Diyabet Tanısında Otoantikorlar – 14.10.2015

DİYABET TANISINDA OTOANTİKORLAR

Günümüzde diyabet sıklığı ve yarattığı sorunlar nedeniyle tüm dünyada önemi gittikçe artan bir sağlık sorunudur. Diyabet tüm dünyada ölüm nedenleri arasında 8. sırada yer almaktadır (1) ve 2013 yılında 5.1 milyon insanın diyabet ve komplikasyonları nedeniyle hayatını kaybettiği rapor edilmiştir (2).

Diyabet tip 1, tip 2, spesifik nedenlere bağlı diyabet ve gebelik diyabeti olmak üzere başlıca 4 gruba ayrılır.

Kronik ve ilerleyici bir hastalık olan Tip 1 diyabet, pankreas beta adacık hücrelerinin yıkımı ile seyreder. Bu yıkımın çoğunlukla otoimmun kökenli olduğu bilinmekle beraber, bazı vakalarda etiyoloji saptanamamaktadır. Genellikle çocukluk ya da adolesan çağda tanı konur. Amerikan Diyabet Birliği (ADA) hastalığın etiyolojik kriterlere göre tip 1A (İmmun aracılı) ve tip 1B (Diyabetin ağır insülin yetersizliği ile seyreden diğer formları) olmak üzere iki ana başlıkta incelenmesini önermektedir (3).

Diyabete özgü otoimmun göstergelerin ölçümü, tip 1A diyabetin erken tip 2 diyabetten ayırımı ve erişkinde gizli otoimmun diyabet (LADA) vakalarının tesbiti gibi durumlarda önemli yararlar sağlamaktadır. Ayrıca tip 1A diyabetin önlenmesine ilişkin çalışmalarda riskli kişilerin tespit edilmesi ve izlenmesinde otoimmun göstergelere ihtiyaç vardır.

“Adacık otoantikoru”, Langerhans adacıklarına veya spesifik olarak insülin salgılayan β hücrelerine yönelik oluşmuş bir grup otoantikor için kullanılan bir tanımdır. Tip1A diyabete yol açan β hücre ölümünün, genetik yatkınlığı olan bireylerde (4) henüz keşfedilmekte olan çevresel faktörlerin (5) başlattığı hücresel aracılı otoimmün bir sürecin (6) sonucu olarak ortaya çıktığı düşünülmektedir.

Adacık otoantikorları genellikle Tip1 diyabetin başlangıcında vardır ve değişen sürelerle kanda bulunur. Daha da önemlisi adacık otoantikorları tip1 diyabet başlangıcından aylar hatta yıllar öncesinden oluşmaktadır (7).

Almanya’da yapılan BABY-DIAB çalışması (8) ve DAISY (Diabetes Autoimmunity Study in the Young) çalışmasına göre adacık otoantikorları yaşamın erken döneminde oluşmakta ve daha sonra ortaya çıkacak olan bir tip1 diyabetin tahmin edilmesini sağlamaktadır. Sürdürülmekte olan TEDDY (The Environmental Determinants of Diabetes in the Young) çalışması gibi benzer çalışmalar vardır. (9)

Adacık otoantikorları tip1 diyabetin sebebi olarak düşünülmemektedir. Bununla birlikte adacık otoantikorlarının pozitif bulunması, bu bireylerde belirli adacık antijenlerinin yabancı olarak algılandığının ve bir immün cevap oluşturduğunun kanıtıdır.

Yeni başlayan Tip 1 diyabetli olgularda birçok yapıya karşı otoantikor oluştuğu saptanmıştır (10) (Tablo 1).

 

Adacık hücre antikoru (ICA), insülin otoantikorları (IAA), anti-glutamat dekarboksilaz antikoru (anti-GAD ya da GADA), anti-tirozin fosfataz antikoru (IA-2) klinik ve araştırma konusu olarak en çok ilgi gören 4 major diyabet otoantikorudur. ZnT8A ise yeni araştırılmakta olan diyabet otoantikorlarından biridir (11).

Ada cık Hücre Antikor u (ICA)

Adacık hücre sitoplazmasına karşı antikorlar sadece β-hücreleri ile değil α, γ, δ ve PP (pankreatik polipeptid) hücreleri ile de etkileşime girerler. Dolayısı ile ICA tek bir yapıya karşı oluşan bir antikor değil, antikor karışımıdır. Adacık hücre antikorlarının tayini indirekt immunofloresan (IF) yöntemi ile yapılır.

Yeni tanı konulan tip 1 diyabette %80-90 gibi oldukça yüksek oranda çocuk olguda ICA pozitif bulunur (12) (Tablo 2). Bir hastada ICA titresinin yüksek bulunması , halen bir miktar Β hücresinin mevcut olduğunun ve bu hücrelerin destrüksiyonunun devam ettiğinin göstergesidir. Zaman içinde hedef dokunun iyice azalması ile titre düşer ve tip 1 diyabet tanısından 10 yıl sonra vakaların çok azında (<%5) ölçülebilir değerde kalır.

ICA tip 1 diyabet gelişiminde önemli bir prediktif göstergedir. Test pozitif çocuklarda, 1. faz insülin yanıtı 1. persentilin altında bulunmuşsa, 5 yıl içinde tip 1 diyabet gelişme olasılığı %50 yi aşmaktadır (13). Bu nedenle, tip 1A diyabetlilerin yakınları başta olmak üzere, riskli kişilerin taranmasında ICA kullanılabilmektedir.

İnsülin Otoantikorları (IAA)

İnsülin β-hücresine spesifik otoantikordur. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) veya tercihen Radio-ligand binding assay (RBA) ya da Radioimmuno assay (RIA) ile tayin edilebilir. Yeni tanı konulan tip 1 diyabetli çocukların %50- 70’inde insülin otoantikoru (IAA) pozitif bulunur. Buna karşılık erişkin hastalarda sadece %20-30 olguda insüline karşı otoantikor vardır (12) (Tablo 2). Yaşı 15’in altında olan diyabetlilerde IAA pozitif bulunma oranı cinsiyet farkı göstermez iken, 15 yaş üzerinde erkek/kadın oranı 2/1’dir (14). İnsülin otoantikorlarının prediktif değeri ICA’ya kıyasla daha zayıftır. Bu nedenle β-hücre otoimmunitesini belirlemede tek başına kullanılmasından ziyade, diğer otoimmun belirteçlerle birlikte destekleyici olarak IAA’dan yararlanılması önerilmektedir.

Gluta mik Asit Dekarboksila z Antikorları (GADA)

1980’li yıllarda tip 1A diyabetli vakalarda tanıdan 10 yıl sonra dahi kalıcı olabilen, 64.000 Dalton ağırlığındaki adacık protein oto-antijenine karşı antikor tanımlanmıştır. 1990 yılında bu otoantijenin gama-amino bütirik asit (GABA) sentezinde hız kısıtlayıcı bir enzim olarak bilinen ve esas olarak merkezi sinir sisteminde bulunmakla birlikte pankreas adacık hücreleri, testis, over, adrenal bez ve böbrek gibi başka bazı ekstranöronal dokularda da sentezlenen glutamik asit dekarboksilaz (GAD) olduğu anlaşılmıştır.

Glutamik asit dekarboksilazın %70 aminoasit homolojisi gösteren 2 izoformu vardır: GAD65 ve GAD67. Bunlardan GAD65’e karşı antikor gelişimi diyabetli hastalarda daha sıktır. GAD65 sadece β-hücreleri değil, tüm pankreas adacık hücrelerinden ekprese edilir, dolayısı ile GADA pozitif olan hastada gelişen antikor tüm adacık hücrelerine karşıdır. Diğer otoantijenlerin aksine, GAD’ın hücresel ve hümoral immuniteyi uyardığına dair kanıtlar vardır. Dolayısı ile GAD’ın tip 1A diyabette bir gösterge olmasının ötesinde etiyolojik bir faktör olduğuna inanılmaktadır.

GADA ölçümü RIA, RBA veya ELISA ile yapılabilir. Son yıllarda geliştirilen, GAD65’e karşı antikorların ölçüldüğü ticari ELISA kitleri ile RIA’dan daha yüksek duyarlılık ve benzer özgüllükte ölçüm yapılabildiği bildirilmektedir (14).

Adacık stoplazmik antikorlarına benzer şekilde, yeni tanı tip 1A diyabetlilerin %70-80 gibi önemli bir kısmında GADA pozitif bulunur (12) (Tablo 2). Bununla birlikte normal populasyonda bulunma oranı ICA’ya kıyasla daha fazladır (%2-3). Bu nedenle GADA prediyabetik dönemde ICA kadar sensitif prediktif değer taşır, ancak ICA daha spesifiktir.

GADA’nın tip 1A diyabet başlangıcından sonra uzun süre persiste etmesi, retrospektif tanıda , özellikle tanıdan birkaç yıl sonra insüline ihtiyaç gösteren geç başlangıçlı tip 1A diyabet (LADA: latent autoimmune diabetes in the adult, erişkinde gizli otoimmun diyabet) olgularında önemli avantaj sağlar (15). Tekrarlanabilir olması ve daha az fluktuasyon göstermesi testin diğer üstünlükleridir.

Anti-tirozin Fosfata z (IA-2) ve Anti-fogrin (IA-2β ) Antikorları

İnsülinoma antijeninin 40.000 Dalton ağırlığındaki intrasellüler fragmanı IA-2 olarak tanımlanmaktadır. IA-2, GAD’a benzer şekilde beyin, pankreas, hipofiz gibi farklı dokulardaki nöroendokrin hücrelerde ekprese edilir.

IA-2 antikorları ölçümünün GADA’ya göre daha az, IAA’ya göre daha yüksek duyarlılık gösterdiği bilinmektedir. Yeni tanı tip 1 diyabette; çocukluk çağındaki olgularda %60-70, erişkinlerde %30-50 oranında pozitif bulunur (12) (Tablo 2). IA-2 antikorları, rezidüel β-hücre fonksiyonu hakkında fikir verir. Yüksek titrasyonlar hızlı progresyon göstergesidir. IA-2 antikorunun hastalığa daha spesifik olduğu bilinmekte, adolesan ve erişkinlerde tip1A diyabet gelişme riskini en iyi gösteren otoimmun gösterge olduğu kabul edilmektedir (16).

Anti-fogrin antikorları, IA-2’ye benzer şekilde, protein tirozin fosfataza benzer bir proteindir ve yine nörosekretuvar hücrelerde eksprese edilir. IA-2β’ya karşı antikor varlığında hemen hemen her zaman IA-2’ye karşı da antikor bulunmakla beraber, bunun tersi doğru değildir, tip 1A diyabetli hastalardan IA-2 antikoru pozitif bulunanların %10’unda IA-2β negatiftir. Bu nedenle ikisinin birden taranması yerine IA-2’ye karşı antikor bakılması yeterli kabul edilmektedir.

Tablo 2: Tip 1 diyabet tanısı konulan hastalarda tanı konulduğu sırada diyabete yönelik otoantikorların pozitif bulunma oranları (12)

(a) Yeni başlangıçlı Tip1DM hastalarında görülme sıklığı.

(b) Bu değer çocuklar içindir; IAA yetişkinde nadir görülür.

Sonuç olarak diyabet otoantikorlarının klinik kullanımı iki ana başlıkta incelenebilir:
1-Akut başlayan ve insülin ihtiyacı olan diyabet vakalarında otoimmuniteye bağlı tip 1A diyabeti konfirme etmek ya da klinik olarak ayrımı yapılamayan durumlarda diyabet tipinin ayrımını yapmak
2-Başta tip 1A diyabetlilerin birinci derece akrabaları olmak üzere tip 1A diyabet açısından yüksek riskli kişileri belirleyip bilgilendirerek diyabeti erken teşhis etmek, mümkünse geciktirmek ve önlemek.

İnsülin eksikliğinin çok belirgin olmadığı durumlarda otoimmun diyabet tanısının olabildiğince erken konularak insülin tedavisine gecikmeden başlanmasının hastada kalan β-hücre rezervini korumada etkili olduğu ve balayı periodunu uzattığı bilinmektedir (19). Bu nedenle şüpheli olgularda otoantikor tetkiki yapılıp hastada otoimmun diabet olup olmadığı netleştirilmelidir. Ayrıca bu hastalarda diğer otoimmun hastalıklara da eğilim olması nedeni ile başta tiroid peroksidaz antikoru (Anti-TPO) olmak üzere, diğer otoantikorların da tetkik edilmesi önerilmektedir.

Kaynaklar

1. World Health Organization. The top ten causes of death . http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en.

2. International Diabetes Federation. Diabetes Atlas 6th edition 2013. http://www.idf.org/diabetesatlas.

3. American Diabetes Association. Clinical practice recommendations 2011, Diagnosis and clasification of diabetes mellitus. Diabetes care 2011;34:62-9.

4. Concannon P, Rich SS, Nepom GT. Genetics of type 1A diabetes. N Eng J med 2009;360:1646-54.

5. Peng H,Hagopian W. Environmental factors in the development of type 1 diabetes.Rev Endoc Metab Disord 2006;7:149-62.

6. Michels AW, Eisenbarth GS. Immunologic endocrine disorders. J Allergy Clin Immunol 2010;125(2 Suppl 2):S226-37.

7. Jahromi MM, Eisenbarth GS. Cellular and molecular pathogenesis of type 1A diabetes. Cell Mol Life Sci 2007;64:865- 72.

8.
 Hummel M, Bonifacio E, Schmid S, Walter M, Knopff A, Ziegler AG. Brief Communication: early appearance of islet autoantibodies predicts childhood type 1 diabetes in offspring of diabetic parents. Ann Intern Med 2004;140:882-6.

9.
 TEDDY study group. The environmental determinants of diabetes in the young (TEDDY) study.Ann NY Acad Sci 2008;1150:1-13.

10. William E. Winter, Desmond A. Schatz. Autoimmune markers in diabetes. Clinical Chemistry. 2011;57:2 168-175.

11. Wenzlau JM,Moua O,Sarkar SA,Yu L. SIC30A8 is a major target of humoral autoimmunity in type 1 diabetes and a predictive marker in prediabetes. Ann NY Acad Sci 2008;1150:256-9.

12. Seissler J,Scherbaum WA.Autoimmune diagnostics in diabetes mellitus. Clin Chem Lab Med 2006;44:133-7.

13. Riley WJ,Maclaren NK,Krisher J,Spillar RP,Silverstein JH,Schatz DA,Schwartz S,Malone J,Shah S,Vadheim C. A prospective study of the development of diabetes in relatives of patients with insülin-dependent diabetes. N Engl J Med 1990;323:1167-72.

14. Tsirogianni A,Pipi E,Soufleros K.Specifity of islet cell autoantibodies and coexistance with other organ spesific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Autoimmunity Rev 2009;8:687-91.

15. Turner R,Stratton I,Horton V,Manley S,Zimmet P,Holman R.UKPDS 25:autoantibodies to islet-cell cytoplasm and glutamic acid decarboxylase for prediction of insulin requirement in type 2 diabetes.UK prospective diabetes Study Group. Lancet 1997;350:1288-93.

16. Achenbach P,Warncke K,Reiter J,Naserke HE,Williams AJ,Bingley PJ,Bonifacio E,Ziegler AG. Stratification of type 1 diabetesrisk on the basis of islet autoantibody characteristics.Diabetes 2004;53:384-92.

17. Orban T,Sosenko JM,Cuthbertson D,Krischer JP,Jackson R et al. Pancreatic islet autoantibodies as predictors of type 1 diabetes in the Diabetes prevention trial-type1. Diabetes Care 2009;32:2269-74.

18. Schatz D,Krischer J,Horne G,Riley W,Spillar R et al. Islet cell antibodies predictinsulin dependent diabetes in United States schoolage children as powerfully as in uneffected relatives. J Clin Invest 1994;93:2403-7.

19. Shah SC,Malone JI,Simpson NE. A randomized trial of intensive insulin therapy in newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus.N Engl J Med 1989;320:550-4.

D Vitamini ve ölçüm yöntemleri – 12.06.2015

D VİTAMİNİ VE ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ

D vitamini eksikliği küresel bir salgın olarak adlandırılmaktadır. Son yıllardaki çalışmalar Vitamin D’nin mineral metabolizması dışında ikincil etkilerinin önemi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Bu nedenle 25-OH-vitamin D (25(OH)D)’nin klinik olarak doğru ölçülmesi çok büyük önem arz etmektedir. Son dönem yeni jenerasyon yöntemler arasında farklılık 25-OH Vitamin D ölçümünün zor olduğunu göstermiştir. LC-MS/MS yöntemi ve metodolojisi üzerine yapılan çalışmalar sonucunda LC-MS/MS ile 25-OH-Vitamin D ölçümü Joint Comittee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) tarafından “referans metod” olarak kabul görmüştür

 

D vitamini; yağda eriyen vitaminler grubunda olup, endojen olarak uygun biyolojik ortamda sentezlenebilmelerinden dolayı hormon ve hormon öncüleri olarak kabul edilen bir grup steroldür. En önemli etkisi kalsiyum ve fosfor metabolizması ile kemik mineralizasyonu üzerinedir. Bununla birlikte son yıllarda, D vitamini eksikliği ile yetersizliğinin yaygın kanser, kardiyovasküler hastalıklar, metabolik sendrom, enfeksiyöz ve otoimmun hastalıklar da dahil olmak üzere bir çok kronik hastalık patogeneziyle ilişkili olduğu saptanmıştır (1,2).

D vitamini eksikliği küresel bir salgın olarak adlandırılmaktadır (3). İngiltere’de yakın zamanda yapılan bir çalışmada; kış ve bahar dönemlerinde erişkin popülasyonun %50’sinden fazlasında D vitamini yetersizliği, %16’sında da ciddi D vitamini eksikliği saptandığı rapor edilmiştir (4). Son yıllarda Uçar ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada; Ankara bölgesinde oldukça yüksek oranda (%51,8) D vitamini eksikliği ve %20,7 oranında D vitamini yetersizliği tespit edilmiştir (5).

Bir ön hormon olan D vitamininin kolekalsiferol (D3 vitamini) ve ergokalsiferol (D2 vitamini) olmak üzere iki kaynağı vardır. Kolekalsiferol 290-310 nm dalga boyundaki ultraviole ışınlarının etkisiyle deride hayvansal kaynaklı olan 7-dehidrokolesterolden sentezlenir ve vücuttaki bu endojen üretim D vitamininin temel kaynağıdır. Bu dönüşüm deri pigmentasyonu arttıkça azalırken, ultraviole ışınına maruz kalma miktarı ile doğru orantılı olarak da artar. Ergokalsiferol ise bitkisel sterol olan ergosterolün irradiasyonuyla oluşur ve daha çok süt ürünlerinin güçlendirilmesi amacıyla kullanılır. Vitamin D3 ve D2 benzer yolla metabolize olduklarından ortak bir isimle, D vitamini olarak adlandırılırlar (6).

Deride yapılan veya diyetle alınan D vitamini biyolojik olarak aktif değildir. Dolaşımdaki D vitamini, vitamin D bağlayıcı protein (DBP) ile karaciğere taşınmakta ve karaciğerde 25 hidroksilaz enzimi ile 25 hidroksivitamin D’ye [25(OH)D], daha sonra da böbreklerde 1-alfa hidroksilaz enzimi ile biyolojik olarak aktif form olan ve kalsitriol olarak da bilinen 1,25 dihidroksivitamin D’ye [1,25(OH)2D] dönüşmektedir. 1-alfa hidroksilaz enzimi D vitamini sentezinde anahtar enzimdir. Bu enzimin düzenlenmesinde parathormon (PTH), kalsiyum (Ca), fosfor ve fibroblast growth faktör 23 (FGF 23) rol oynamaktadır (3,7). 1,25(OH)2D ince barsak, böbrek ve diğer dokularda bulunan vitamin D reseptörleri üzerinden etkisini gösterir. İnce barsaktan Ca absorbsiyonunu arttırarak, böbreklerden de Ca kaybını azaltarak genel fonksiyonu olan kan kalsiyum düzeyini korur. Ayrıca 1,25(OH)2D vitamininin, hücre proliferasyonunu inhibe edici, terminal diferansiyasyonu uyarıcı, anjiogenezi inhibe edici, insülin üretimini uyarıcı ve renin üretimini inhibe edici biyolojik etkileri mevcuttur (7,8). D vitamini ve metabolitleri birçok dokuda bulunan 24 hidroksilaz enzimi tarafından inaktive edilerek safra yoluyla atılmaktadır (Şekil 1), (3,9).

 

Bireysel vitamin D düzeylerini değerlendirmek için yarı ömrü 2-3 hafta olan, hem vitamin D alımını hem de endojen yapımı gösteren 25(OH)D düzeyine bakılmalıdır. Biyolojik aktif form 1,25(OH)2D ideal ölçüm için uygun değildir. Çünkü yarı ömrü 4-6 saat kadar kısa ve dolaşımdaki düzeyleri 25(OH)D’den 1000 kat daha düşüktür. D vitamini eksikliği ve yetersizliğinin tanımlanması ve 25(OH)D düzeyinin normal aralığının saptanması için birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmaların ışığında, 25(OH)D düzeyi ve yorumu Tablo 1’ de özetlenmiştir (3,8).

D Vitamini Düzeyine Hangi Durumlarda Bakılmalıdır?

  • Kemik hastalığı olan kişiler (osteomalazi, osteoporoz, paget vs.).
  • D vitamini eksikliğini düşündüren kas-iskelet sistemine ait semptomları olan kişiler
  • D vitamini eksikliği ve yetersizliği konusunda risk faktörleri olanlar (koyu tenli kişiler, güneş ışığından yeterince yararlanamayanlar, yaşlılar, obezler, kısa aralıkla sık hamile olanlar, emziren kadınlar, malabsorbsiyon durumları, antikonvülsan ve glukokortikoid ilaç kullanımı vs.).

 

Vit D ölçümünde esas olarak iki ana metadoloji kullanılmaktadır. Bunlar; kompetitif immunoassayler (RIA, enzyme immunoassay, chemiluminescent immunoassay (CLIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLİA) ve competitive protein binding assay) ve kimyasal tespit yöntemleridir. Kimyasal tespit yöntemlerinin temelini kromatografik ayırma sonrasında immunolojik olmayan direkt tespit oluşturmaktadır (HPLC ve LC-MS/ MS). Her iki yöntemin de avantajları ve dezavantajları olmasının yanısıra bu yöntemler arasında temel fark HPLC ve LC-MS/MS’ in 25OHD2 ile 25OHD3 ü ayırabilmeleridir.

 

Likit Kromatografi-Kütle Spektrometre (LC-MSMS)

Kütle spektrometreleri manyetik veya elektriksel bir alanda hareket eden yüklü partikülleri kütle/yük (m/z) oranlarına göre diğer yüklü partiküllerden ayırt ederek analizleme esasına göre çalışan cihazlardır. Moleküller normalde yüklü partiküller değillerdir. Kütle spektrometreleri iyonizasyon işlemi ile molekülleri uyararak yüklü iyonize moleküller haline dönüştürürler. Yüklü moleküller stabil olmayıp, diğer moleküllerle veya bir yüzey ile temas ettikleri zaman fragmentlerine parçalanır ve yüklerini kaybederler. Oluşan her bir iyon, spesifik bir moleküler kütleye ve yüke sahiptir ve m/z değerlerinin yoğunluğa (intensite) karşı gösterildiği bir spektrum ile bileşik tanımlanmaktadır.

Kütle spektrometreleri iyon kaynağına giren bütün bileşikleri ayrıştırır ve iyonlaştırır. Organik bileşiklerin içerisinde çok fazla sayıda molekül mevcuttur ve hepsinin kütle fragmenti izlenir. Bu nedenle iyi bir spektrum elde etmek amacıyla belirli bir sürede sadece saf bir bileşiğin kütle spektrumunu almak gereklidir. Seçimliliği yükseltmek ve deteksiyon limitlerini artırmak için kütle spektrometresinden (MS)’den önce numunenin ekstraksiyon, derivatizasyon, kromatografik ayrıştırmalar gibi bazı ön muamelelerden geçirilmesi gereklidir. Bunun için en uygun yöntemlerden birisi iki veya daha fazla analitik tekniğin art arda (tandem) bağlanmasıdır (Likit Kromatografi–Kütle Spektrometresi: LC-MS).

Analiz hızını artırmak, kompleks karışımlarda deteksiyon limitini artırmak, çoğunlukla ön işlemlere gereksinim kalmadan kompleks karışımların hızlı, hassas ve selektif olarak analizini yapmak için iyon yolunda birden fazla MS bulunabilir (Şekil 2).

 

Bu sistemlerde, komponentler arasında “collision chamber” (Çarpışma odası) bulunmaktadır. Birinci kütle analizörde seçilen ana iyon (parent) “collision chamber”da argon gibi inert bir gaz etkisiyle fragmentlerine ayrıştırılmakta (yavru iyon, daughter ion) ve bu fragmentler tekrar ikinci kütle analizörde analizlenmektedirler (10,11), (Şekil 3).

 

Kütle spektrometresinde kantitatif doğruluk analitik işlemin başlangıcında eklenen uygun internal standart (IS) ile sağlanır. Seçilen IS’ın ilgilenilen bileşiğin kimyasal yapısına uygun olması gerekir. Böylece IS’ın fiziksel ve kimyasal özelliklerinin, bilinmeyen maddeninki ile uyumlu olması sağlanır. Bu sebeple döteryumla işaretlenmiş bileşiklerin IS olarak kullanımı yaygındır. Bir bileşiğin analizinde kullanılan döteryumlanmış IS’ın tek farkı bir veya birkaç hidrojen atomu yerine döteryum atomlarının geçmiş olmasıdır (10,12).

Kütle spektrometrelerinin biyokimyada kullanımı 1956 yılında steroidlerin analizi ile başlamış, 1960’lı yıllarda peptid ve nükleosidlerin sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. İlk defa 1966 yılında Tanaka ve arkadaşlarının gaz kromatografi- kütle spektrometresi (GC-MS) ile izovalerik asidemiyi tanımlamalarıyla birlikte cihaz metabolik hastalıkların tanısında kullanılmaya başlamıştır (13). 1980’li yıllarda tandem kütle spektrometresi (TMS) geliştirilmiş ve birçok alanda kullanıma sunulmuştur. Günümüzde LC-MS/MS’in tıp alanında kullanımı gittikçe artan bir öneme sahiptir. Yüksek hassasiyeti ve güvenilirliği, analiz süresinin kısa olması ve bilgisayar kontrollü programlar sayesinde, kütle spektrometreleri artık birçok hastalığın tanısına yaklaşımda son derece kuvvetli bir analitik teknik haline gelmiştir.

25-OH-vitamin D (25(OH)D)’nin klinik olarak doğru ölçülmesi çok büyük önem arz etmektedir. Bunun için bir standartlaştırma gerekmektedir. DEQAS (Vitamin D External Quality Assessment Scheme) sonuçlarına göre; serum 25-OHD düzeylerinde ölçüm metodlarına bağlı olarak laboratuvarlar arası değişkenlikler mevcuttur. Bu değişkenliklerin nedeni; molekülün hidrofobik ve lipofilik yapısının matriks etkisine yol açması, D Vitamini Bağlayıcı Protein (DBP)’e güçlü şekilde bağlanması nedeniyle deproteinizasyon prosedürleri gerektirmesi, dolaşımda çok düşük konsantrasyonlarda (nanomolar) olmaları ve D2 ve D3’ün benzer yapısal özelliklerinin metadolojik problemlere neden olmasıdır (14,15).

Yakın zamana kadar vitamin D ölçümünde kabul edilmiş bir referans yöntem prosedürü (RMP) mevcut değildi. LC-MS/MS yöntemi ve metodolojisi üzerine yapılan çalışmalar ve 2010 yılında Tai ve arkadaşları tarafından geliştirilen aday referans metod çalışması sonucunda, LC-MS/ MS ile vit D ölçümü Joint Comittee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) tarafından “referans metod” olarak kabul görmüştür (16.17). Ayrıca US National Institute of Standards and Technologies (NIST), 25(OH)D3 ve 25(OH)D2 içeren etanol bazlı iki kalibratör standard referans materyal (SRM 2972) ve RMP olarak ortaya konan LC-MS/MS ile değerleri belirlenmiş olan dört adet serum bazlı standart referans materyelini de (SRM 972) kullanıma sunmuştur. Bunun sonucunda yöntemler arası uyumu en çok etkileyen sorunlardan biri olan kalibrasyon sorununun ortadan kalkması öngörülmüştür (18,19,20). Referans bir yöntem ve sertifikalı referans malzemelerin kullanımı ölçüm yöntemlerinin standardizasyonu ve karşılaştırılabilirliğini sağlayacaktır. Günümüzde, NIST (National Institute of Standardsand Technology) standard referans materyali (SRM) ve referans ölçüm prosedürlerinin kullanıma girmesi ile laboratuvarlar arası ölçüm değişkenliği giderek azalmaktadır.

Vitamin D ölçümünde ilk kullanılan ölçüm yöntemi 1971’de bildirilen Vitamin D binding protein’nin bağlayıcı olduğu kompetitif protein bağlama yöntemidir (21). Yöntemin avantajı DBP’nin 25(OH)D2 ile 25 (OH)D3’ü eşit olarak tanımasıdır. Yöntemin kısıtlılığı ise ölçümde 24,25(OH) 2D, 25,26 (OH) 2D, 23- Lactone gibi diğer polar vitamin D metabolitlerini de kapsaması ve 10 gün gibi uzun inkübasyon süresinin olmasıdır. Ancak Silisik asit kromotografisinin kullanıldığı kompetitif protein bağlama yöntemi geliştirilerek inkübasyon süresi 1 saate düşürülmüştür (21-23).

1977’de High Performance Liquid Chromotography (HPLC) geliştirilmiştir. Bu yöntemde UV absorbsiyon yolu ile ölçüm yapılmaktadır. Yöntemin avantajları; interferans veren lipidlerin ve vitamin D metabolitlerinin uzaklaştırması, 25(OH)D2 ve 25(OH)D3’i ayrı ayrı ölçebilmesi, stabil, spesifik, cost-effective ve tekrarlanabilirliğinin yüksek olmasıdır (21,23). Yöntemin dezavantajları ise iyi bir donanım ve deneyim gerektirmesi, ekipman maliyeti ve numune miktarının fazla olması, hazırlayıcı kromatografi gerektirmesi, interferans yapıcı UV bileşiklerden etkilenebilmesi ve test sonuçlanma sürensinin uzun olmasıdır.

1985’te RIA (Diasorin) geliştirilmiştir. Bu yöntem için örnek saflaştırması gerekli olmamaktadır. Bu yöntemin uygulaması kolay ve sonuçları HPLC ölçümü ile koreledir. Hızlı, ucuz ve doğru yöntemlerdir. İnterferansları yoktur ve numune miktarı azdır. Ancak radyoaktif ve kimyasal atık oluşturmaları, 24,25(OH)D3, 24,25(OH)D2 ve 25(OH) D3-26,23-lactone gibi polar vitamin D metabolitleri ile çapraz reaksiyon vermesi ölçümlerin %10-20 daha yüksek verilmesine neden olmaktadır. RIA (IDS) yöntemi ise 25(OH)D3’e %100, 25(OH) D2’ye %75 spesifiktir (21, 23, 24).

ELISA yöntemi RIA ve Kompetitif protein bağlama ölçümdeki gibi diğer polar vitamin D metabolitlerini de kapsamaktadır (24,25(OH) 2D, 25,26(OH) 2D, 23-lactone) (21)

Tüm dünyada artan vitamin D test sayıları laboratuvarları daha basit ve hızlı sonuç veren kemiluminesans yöntemleri kullanmaya yöneltmiş olsa da, bu yöntemlerinde birtakım dezavantajları mevcuttur (Tablo 2);

Son yıllarda “altın standard yöntem” olarak kabul edilen LC-MS/MS, internal standard kullanılmasından ve metadolojiden dolayı daha doğru ve kesin sonuçlar vermektedir. LC-MS/MS yöntemi, 25-OH-vitamin D3 (25(OH)D3) ve 25-OH-vitamin D2 (25(OH)D2) vitaminlerinin serum veya plazmada ekstraksiyondan sonra kantitatif olarak ölçülmesine dayanır. Bu da özellikle tedavilerinde D2 vitamini kullanılan hastalarda doğru sonuç elde etmek ve tedavinin takibi açısından önemlidir.

Ayrıca 2004 yılında Kamao ve arkadaşları tarafından 25- (OH)D’nin izomerizasyon sonrasında 3-epi-25-(OH)D epimerini oluşturduğu tespit edilmiştir (25). Bu epimer bebekler ve özellikle bir yaşından küçük çocuklarada 25- (OH)D düzeyinin önemli bir kısmını oluşturmaktadır (26). Vitamin D düzeylerinin doğru bir şekilde belirlenebilmesi için bu epimerik formların birbirinden ayırdedilmesi gerekmektedir. LC-MS/MS kullanılarak bu epimerik formun kromatografik olarak ayrımı mümkündür.

2012 Yılında Farrell J. ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada (27), randomize seçilen 170 hasta örneği uygun şartlarda bölünerek saklanmış ve bu örneklerden;

  • 2 farklı LC-MS/MS yöntemi
  • RIA
  • 5 farklı İmmunoassay (CLIA) kullanılarak
    – Düşük ve yüksek serum havuzu hazırlanmış
    – Her yöntem 5 tekrarlı 5 gün çalışılmıştır.

Çalışmadan elde edilen verilere göre farklı yöntemlerin korelasyon katsayısı, pearson precision ve bias korelasyon açısından değerlendirilmesi sonucu Tablo 3’de, precision çalışması ise Tablo 4’de özetlenmiştir. Bu sonuçlara göre LC-MS/MS ile yapılan ölçümlerde gün içi ve günler arası %CV’lerin düşük, presizyonun ise yüksek olduğu görülmektedir.

Sonuç olarak;

  • Son yıllardaki çalışmalar Vitamin D’nin mineral metabolizması dışında ikincil etkilerinin önemi üzerinde yoğunlaşmaktadır.
  • Vitamin D’nin otoimmun hastalıklar, kanser, enfeksiyon ve kardiyovasküler mekanizmalar üzerinde koruyucu ve önleyici bir etkisi olduğunu düşündürmektedir.
  • Günümüzde klinik açıdan 25-OH Vitamin D’nin doğru olarak ölçülmesi önemlidir.
  • Son dönem yeni jenerasyon yöntemler arasında farklılık 25-OH Vitamin D ölçümünün zor olduğunu göstermiştir.
  • Laboratuvarlar 25-OH vitamin D ölçüm metodlarını
  1. Doğruluk (Accuracy)
  2. Precision
  3. Verimlilik
  4. Maliyet
  5. İş akışlarına göre

Seçmeliler ve mutlaka çok dikkatli bir şekilde metodlarını valide etmelidirler.

  • Şüpheli Immunoassay sonuçları mutlaka LCMSMS ile doğrulanmalıdır.

KAYNAKLAR

1. Holick MF. Vitamin D: a D-lightful health perspective. Nutr Rev 2008;66: 182-94.

2.
 Hyppönen E, Boucher BJ, Berry DJ, Power C. 25-hydroxyvitamin D, IGF-1, and metabolic syndrom at 45 years of age: a cross-sectional study in the 1958 British Birth Cohort. Diabetes 2008; 57:298-305.

3. Wacker M, Holick MF. Vitamin D-Effects on Skeletal and Extraskeletal Health and the Need for Supplementation. nNutrients 2013;5:111-48.

4. Pearce SHS, Cheetham TD. Diagnosis and management of vitamin D deficiency. BMJ 2010;340:b5664.

5.
 Uçar F, Taşlıpınar MY, Soydaş AÖ, Özcan N. Ankara Etlik İhtisas Eğitim Araştırma Hastanesi’ne Başvuran Hastalarda 25-OH Vitamin D Düzeyleri. Eur J Basic Med Sci 2012;2: 12-5.

6. Koo WWK, Tsang RC. Calcium and Magnesium Homeostasis. In: MacDonald MH, Seshia MMK, Mullet MD, eds. (2005) Avery’s Neonatology Pathophysiology & Management of the Newborn, 6th edition. Philadelphia: Lippincott W&W. 847-875.

7. Öngen B, Kabaroğlu C, Parıldar Z. D Vitamini’nin Biyokimyasal ve Laboratuvar Değerlendirmesi. Türk Klinik Biyokimya Dergisi 2008;6:23-31.

8. Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA, Gordon MC, Hanley DA, Heaney RP et al. Evaluation ,Treatment, and Prevention of Vitamin D Deficiency: an Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab 2011;96:1911-30.

9. Bringhurst FR, Demay MB, Krane SM, Kronenberg HM. Bone and Mineral Metabolism in Health and Disease. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, editors. Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16th edition. New York:MCGraw-Hill Companies; 2005. p. 2238-86.

10. Lehrer M. In Kaplan LA. Mass spectrometry.St. Louis:Mosby Company, 1996; 167-84.

11.
 Hochstrasser DF, Sanchez JC, Appel RD. Proteomics and its trends facing nature’s complexity. Proteomics 2002; 2:807-12.

12. Andersen BD, Wise BL. Textbook of clinical chemistry. Philadelphia: WB Saunders Company, 1986; 197-208.

Closstiridium difficile İnfeksiyonlarının Laboratuvar Tanısı – 28.05.2015

CLOSTRIDIUM DIFFICILE İNFEKSİYONLARININ LABORATUVAR TANISI

Clostridium difficile, Gram pozitif, anaerop, sporlu bir basildir. C.difficile infeksiyonları antibiyotiğe bağlı diyareden, ağır psödomembranöz kolite kadar değişebilmektedir. Virülanstaki farlılıklar ve antibiyotik tedavisindeki değişiklikler nedeniyle son dönemlerde C.difficile infeksiyonlarının morbidite ve mortalitesinde artış gözlenmektedir. Bu nedenle tanıda hızlı ve duyarlı yöntemlere gereksinim duyulmaktadır. Tanıda altın standart toksijenik kültür yöntemidir fakat hızlı tanıda pratik değillerdir. Yeni nesil, Real-time PCR yöntemi, Hızlı ve ELISA ile karşılaştırıldığında daha duyarlı bir yöntemdir.

CLOSTRIDIUM DIFFICILE İNFEKSİYONLARININ
LABORATUVAR TANISI

Clostridium difficile, Gram pozitif, anaerop, sporlu bir basildir.

C.difficile’nin toksijenik ve toksijenik olmayan kökenleri sağlıklı bireylerde asemptomatik olarak bulunabilir. Sağlıklı erişkinlerde taşıyıcılık oranı yaklaşık % 5 iken, yenidoğan bebeklerde % 70 civarındadır. Toksijenik suşlarla kolonize olan yenidoğanlarda infeksiyon görülme sıklığı azdır çünkü yenidoğan barsak mukoza epitelinde toksin reseptörleri henüz gelişmemiştir. (2,5,7)

C.difficile sporları hastanelerde, bakımevlerinde yaygın olarak bulunmaktadır. Bu sporlar çevreden ya da taşıyıcı hastalardan, sağlık personelinin elleri ile diğer hastalara geçirilmektedir. Hastanede yatan hastalarda % 50’lere varabilen kolonizasyon oranları bildirilmektedir. (2,5,7)

C.difficile infeksiyonları antibiyotiğe bağlı diyareden, ağır psödomembranöz kolite kadar değişebilmektedir. C.difficile infeksiyonlarında kanlı ve mukuslu ishal, kramp şeklinde karın ağrısı, lökositoz ve ateş görülebilir. (2,5,7)

Günümüzde özellikle hastanede yatan, altta yatan hastalığı bulunan, yaşlı hastalarda antibiyotik kullanımı ile ilişkili infeksiyonlara neden olan C.difficile’nin toplumdan kazanılmış infeksiyonlara da neden olduğu bilinmektedir. (2,5,7)

C.difficile’ye bağlı ishal oluşumunda en önemli risk faktörlerinden birisi antibiyotik ve kemoterapötik kullanımıdır. İnfeksiyon, antibiyotik veya antineoplastik ajanların kullanımı sırasında barsak florasının bozulmasıyla meydana gelmektedir.(2,5,7)

C.difficile’nin Toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin) olmak üzere iki önemli toksini vardır. Bakterinin virulansı bu iki toksinin üretimine bağlıdır. Bu toksinler epitel hücrelerinde inflamasyona ve mukozal bütünlüğün bozulmasına neden olmaktadırlar. (2,5,7)

Toksijenik suşların genomunda bulunan patojenite lokusunda bulunan tcdA ve tcdB genleri toksinlerin sentezinden sorumludurlar. Çeşitli ülkelerde hastane salgınlarına yol açan virülansı yüksek B1/NAP1/027 kökeninin, tcdC geninde delesyon olduğu, buna bağlı olarak yüksek düzeyde toksin A ve B salgıladığı bildirilmiştir. (2,5,7)

B1/NAP1/027 kökeninin aynı zamanda ‘’binary toksin’’ olarak tanımlanan üçüncü bir toksin ürettiği de gösterilmiştir. Patojenite lokusu dışındaki cdtA ve cdtB genleri ‘’binary’’ toksini (CDT) kodlamaktadır. Bu toksinin epitel hücre yüzeyinde mikrotübül oluşumunu indüklediği ve daha çok sayıda bakterinin hücre yüzeyine tutunmasını sağladığı düşünülmektedir. Bu nedenle bu toksin daha şiddetli infeksiyonlara neden olmaktadır. (2,5,7)

Binary toksin, C.difficile kökenlerinde tek başına bulunabilir, diğer toksin A ve toksin B salgılayan veya varyant kökenlerde de bulunabilir. En sık (%65) tcdA ve tcdB toksinlerinin ikisini de üreten kökenler görülmektedir. TcdB ise kökenlerin %97’si tarafından üretilir.

Hipervirülan epidemik suşun bir diğer özelliği de diğer suşlardan farklı olarak florokinolonlara dirençli oluşudur. (2,5,7)

LABORATUVAR TANI (1,2,3,4,5,6,7):

Virülanstaki farlılıklar ve antibiyotik tedavisindeki değişiklikler nedeniyle son dönemlerde C.difficile infeksiyonlarının morbidite ve mortalitesinde artış gözlenmektedir. Bu nedenle tanıda hızlı ve duyarlı yöntemlere gereksinim duyulmaktadır.

Tanıda altın standart toksijenik kültür yöntemidir. (Anaerop kültür+Hücre kültürü sitotoksin testi) Özgüllük ve duyarlılığı yüksektir. Toksin B’yi saptar. Bu testler zaman alan (3 gün), özel ekipman ve deneyimli eleman gerektiren, maliyeti yüksek testlerdir. Bu yüzden hızlı tanıda pratik değillerdir.

EIA ile C.difficile GDH saptanması. Glutamat Dehidrogenaz çoğu toksijenik ve nontoksijenik Clostridium difficile kökenlerinde bulunabilen bir hücre yüzey proteinidir. Bu test hızlıdır ancak toksijenik ve toksijenik olmayan suşları birbirinden ayıramamaktadır. GDH’yı tespit eden testlerde düşük spesifisitesinden dolayı pozitiflik saptandığında daha spesifik bir yöntemle (ELISA, hücre kültürü, moleküler yöntemler gibi toksin üreten genleri tanımlayan yöntemlerle) doğrulanmalıdır.

Toksin A ve B için ELISA: Hızlı ve kolay testler olmasına rağmen bu testlerin genellikle duyarlılıkları ve özgüllükleri hücre kültür sistemlerine ve moleküler yöntemlere göre düşüktür. ELISA ile ancak 100-1000 pg toksin A veya B saptanabilmektedir. Bu nedenle %10-20 oranında bir yalancı negatiflik söz konusudur.

Moleküler testler toksijenik C.difficile DNA’sının amplifikasyonuna dayanır. Hız ve güvenilirlik avantajları vardır. Aynı zamanda çok daha şiddetli infeksiyonlara neden olan binary toksin ve varyant kökenleri saptayabilme avantajları vardır.

Real-time PCR yöntemi, tcdB, CdtA ve CdtB genlerine sahip kökenleri (binary toksin) ve tcdC genindeki delesyonları da belirleyebilir. Hızlı ve ELISA ile karşılaştırıldığında daha duyarlı bir yöntemdir.( Duyarlılık % 88-96, Özgüllük %94-100)

Günümüzde yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri, binary toksin ve varyant kökenleri saptayabilme avantajlarından dolayı bu testler klinik pratikte toksijenik C.difficile’nin saptanmasında ELISA testlerinin yerini almaktadırlar.

 

KAYNAKLAR

1. Susan M.NW, Elizabeth M.M et al. 2010. Clostridium difficile testing in the clinical laboratory by use of multiple testing algorithms. Journal of Clinical Microbiology, Mar.2010, p.889-893

2.
 Bartlett JG and Gerding DN.2008. Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis 46(Suppl 1):S12-S18.

3.
 Haihui H, Andrej W et al. 2009. Comparison of a commercial multiplex real-time PCR to the cell cytotoxicity neutralization assay for diagnosis of Clostridium difficile infections. Journal of Clinical Microbiology, Nov. 2009, p.3729-3731.

4. Kimberle Chapin. 2012. Discrepancies in testing recommendations for Clostridium difficile infection: updated review favors amplification test systems. Expert Rev. Mol. Diagn. 12(3), 223-226 (2012).

5. Deniz U, Ülger N ve ark.2011. Marmara Üniversitesi Hastanesinde yatan ishalli hastalardan izole edilen Clostridium difficile kökenlerinde toksin genlerinin araştırılması. Mikrobiyol Bul 2011; 45 (1):1-10.

6.
 Elizabeth J Kvach, David Ferguson et al. Comparison of BD GeneOhm Cdiff Real-Time PCR assay with a two step algorithm and a toxin A/B enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of toxigenic Clostridium difficile infection. J.Clin.Microbiol.
2010, 48(1):109.

7. Murray Patrick R, Baron Ellen Jo. Manual of Clinical Microbiology, Cilt 2, 9.Baskı, s.889-910