D Vitamini Ve Ölçüm Yöntemleri

D Vitamini ve Ölçüm Yöntemleri

D vitamini eksikliği küresel bir salgın olarak adlandırılmaktadır. Son yıllardaki çalışmalar Vitamin D’nin mineral metabolizması dışında ikincil etkilerinin önemi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Bu nedenle 25-OH-vitamin D (25(OH)D)’nin klinik olarak doğru ölçülmesi çok büyük önem arz etmektedir. Son dönem yeni jenerasyon yöntemler arasında farklılık 25-OH Vitamin D ölçümünün zor olduğunu göstermiştir. LC-MS/MS yöntemi ve metodolojisi üzerine yapılan çalışmalar sonucunda LC-MS/MS ile 25-OH-Vitamin D ölçümü Joint Comittee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) tarafından “referans metod” olarak kabul görmüştür

D vitamini; yağda eriyen vitaminler grubunda olup, endojen olarak uygun biyolojik ortamda sentezlenebilmelerinden dolayı hormon ve hormon öncüleri olarak kabul edilen bir grup steroldür. En önemli etkisi kalsiyum ve fosfor metabolizması ile kemik mineralizasyonu üzerinedir. Bununla birlikte son yıllarda, D vitamini eksikliği ile yetersizliğinin yaygın kanser, kardiyovasküler hastalıklar, metabolik sendrom, enfeksiyöz ve otoimmun hastalıklar da dahil olmak üzere bir çok kronik hastalık patogeneziyle ilişkili olduğu saptanmıştır (1,2).

D vitamini eksikliği küresel bir salgın olarak adlandırılmaktadır (3). İngiltere’de yakın zamanda yapılan bir çalışmada; kış ve bahar dönemlerinde erişkin popülasyonun %50’sinden fazlasında D vitamini yetersizliği, %16’sında da ciddi D vitamini eksikliği saptandığı rapor edilmiştir (4). Son yıllarda Uçar ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada; Ankara bölgesinde oldukça yüksek oranda (%51,8) D vitamini eksikliği ve %20,7 oranında D vitamini yetersizliği tespit edilmiştir (5).

Bir ön hormon olan D vitamininin kolekalsiferol (D3 vitamini) ve ergokalsiferol (D2 vitamini) olmak üzere iki kaynağı vardır. Kolekalsiferol 290-310 nm dalga boyundaki ultraviole ışınlarının etkisiyle deride hayvansal kaynaklı olan 7-dehidrokolesterolden sentezlenir ve vücuttaki bu endojen üretim D vitamininin temel kaynağıdır. Bu dönüşüm deri pigmentasyonu arttıkça azalırken, ultraviole ışınına maruz kalma miktarı ile doğru orantılı olarak da artar. Ergokalsiferol ise bitkisel sterol olan ergosterolün irradiasyonuyla oluşur ve daha çok süt ürünlerinin güçlendirilmesi amacıyla kullanılır. Vitamin D3 ve D2 benzer yolla metabolize olduklarından ortak bir isimle, D vitamini olarak adlandırılırlar (6).

Deride yapılan veya diyetle alınan D vitamini biyolojik olarak aktif değildir. Dolaşımdaki D vitamini, vitamin D bağlayıcı protein (DBP) ile karaciğere taşınmakta ve karaciğerde 25 hidroksilaz enzimi ile 25 hidroksivitamin D’ye [25(OH)D], daha sonra da böbreklerde 1-alfa hidroksilaz enzimi ile biyolojik olarak aktif form olan ve kalsitriol olarak da bilinen 1,25 dihidroksivitamin D’ye [1,25(OH)2D] dönüşmektedir. 1-alfa hidroksilaz enzimi D vitamini sentezinde anahtar enzimdir. Bu enzimin düzenlenmesinde parathormon (PTH), kalsiyum (Ca), fosfor ve fibroblast growth faktör 23 (FGF 23) rol oynamaktadır (3,7). 1,25(OH)2D ince barsak, böbrek ve diğer dokularda bulunan vitamin D reseptörleri üzerinden etkisini gösterir. İnce barsaktan Ca absorbsiyonunu arttırarak, böbreklerden de Ca kaybını azaltarak genel fonksiyonu olan kan kalsiyum düzeyini korur. Ayrıca 1,25(OH)2D vitamininin, hücre proliferasyonunu inhibe edici, terminal diferansiyasyonu uyarıcı, anjiogenezi inhibe edici, insülin üretimini uyarıcı ve renin üretimini inhibe edici biyolojik etkileri mevcuttur (7,8). D vitamini ve metabolitleri birçok dokuda bulunan 24 hidroksilaz enzimi tarafından inaktive edilerek safra yoluyla atılmaktadır (Şekil 1), (3,9).

 

Bireysel vitamin D düzeylerini değerlendirmek için yarı ömrü 2-3 hafta olan, hem vitamin D alımını hem de endojen yapımı gösteren 25(OH)D düzeyine bakılmalıdır. Biyolojik aktif form 1,25(OH)2D ideal ölçüm için uygun değildir. Çünkü yarı ömrü 4-6 saat kadar kısa ve dolaşımdaki düzeyleri 25(OH)D’den 1000 kat daha düşüktür. D vitamini eksikliği ve yetersizliğinin tanımlanması ve 25(OH)D düzeyinin normal aralığının saptanması için birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmaların ışığında, 25(OH)D düzeyi ve yorumu Tablo 1’ de özetlenmiştir (3,8).

D Vitamini Düzeyine Hangi Durumlarda Bakılmalıdır?

• Kemik hastalığı olan kişiler (osteomalazi, osteoporoz, paget vs.).
• D vitamini eksikliğini düşündüren kas-iskelet sistemine ait semptomları olan kişiler
• D vitamini eksikliği ve yetersizliği konusunda risk faktörleri olanlar (koyu tenli kişiler, güneş ışığından yeterince yararlanamayanlar, yaşlılar, obezler, kısa aralıkla sık hamile olanlar, emziren kadınlar, malabsorbsiyon durumları, antikonvülsan ve glukokortikoid ilaç kullanımı vs.).

Vit D ölçümünde esas olarak iki ana metadoloji kullanılmaktadır. Bunlar; kompetitif immunoassayler (RIA, enzyme immunoassay, chemiluminescent immunoassay (CLIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLİA) ve competitive protein binding assay) ve kimyasal tespit yöntemleridir. Kimyasal tespit yöntemlerinin temelini kromatografik ayırma sonrasında immunolojik olmayan direkt tespit oluşturmaktadır (HPLC ve LC-MS/ MS). Her iki yöntemin de avantajları ve dezavantajları olmasının yanısıra bu yöntemler arasında temel fark HPLC ve LC-MS/MS’ in 25OHD2 ile 25OHD3 ü ayırabilmeleridir.

Likit Kromatografi-Kütle Spektrometre (LC-MSMS)

Kütle spektrometreleri manyetik veya elektriksel bir alanda hareket eden yüklü partikülleri kütle/yük (m/z) oranlarına göre diğer yüklü partiküllerden ayırt ederek analizleme esasına göre çalışan cihazlardır. Moleküller normalde yüklü partiküller değillerdir. Kütle spektrometreleri iyonizasyon işlemi ile molekülleri uyararak yüklü iyonize moleküller haline dönüştürürler. Yüklü moleküller stabil olmayıp, diğer moleküllerle veya bir yüzey ile temas ettikleri zaman fragmentlerine parçalanır ve yüklerini kaybederler. Oluşan her bir iyon, spesifik bir moleküler kütleye ve yüke sahiptir ve m/z değerlerinin yoğunluğa (intensite) karşı gösterildiği bir spektrum ile bileşik tanımlanmaktadır.

Kütle spektrometreleri iyon kaynağına giren bütün bileşikleri ayrıştırır ve iyonlaştırır. Organik bileşiklerin içerisinde çok fazla sayıda molekül mevcuttur ve hepsinin kütle fragmenti izlenir. Bu nedenle iyi bir spektrum elde etmek amacıyla belirli bir sürede sadece saf bir bileşiğin kütle spektrumunu almak gereklidir. Seçimliliği yükseltmek ve deteksiyon limitlerini artırmak için kütle spektrometresinden (MS)’den önce numunenin ekstraksiyon, derivatizasyon, kromatografik ayrıştırmalar gibi bazı ön muamelelerden geçirilmesi gereklidir. Bunun için en uygun yöntemlerden birisi iki veya daha fazla analitik tekniğin art arda (tandem) bağlanmasıdır (Likit Kromatografi–Kütle Spektrometresi: LC-MS).

Analiz hızını artırmak, kompleks karışımlarda deteksiyon limitini artırmak, çoğunlukla ön işlemlere gereksinim kalmadan kompleks karışımların hızlı, hassas ve selektif olarak analizini yapmak için iyon yolunda birden fazla MS bulunabilir (Şekil 2).

 

Bu sistemlerde, komponentler arasında “collision chamber” (Çarpışma odası) bulunmaktadır. Birinci kütle analizörde seçilen ana iyon (parent) “collision chamber”da argon gibi inert bir gaz etkisiyle fragmentlerine ayrıştırılmakta (yavru iyon, daughter ion) ve bu fragmentler tekrar ikinci kütle analizörde analizlenmektedirler (10,11), (Şekil 3).

 

Kütle spektrometresinde kantitatif doğruluk analitik işlemin başlangıcında eklenen uygun internal standart (IS) ile sağlanır. Seçilen IS’ın ilgilenilen bileşiğin kimyasal yapısına uygun olması gerekir. Böylece IS’ın fiziksel ve kimyasal özelliklerinin, bilinmeyen maddeninki ile uyumlu olması sağlanır. Bu sebeple döteryumla işaretlenmiş bileşiklerin IS olarak kullanımı yaygındır. Bir bileşiğin analizinde kullanılan döteryumlanmış IS’ın tek farkı bir veya birkaç hidrojen atomu yerine döteryum atomlarının geçmiş olmasıdır (10,12).

Kütle spektrometrelerinin biyokimyada kullanımı 1956 yılında steroidlerin analizi ile başlamış, 1960’lı yıllarda peptid ve nükleosidlerin sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. İlk defa 1966 yılında Tanaka ve arkadaşlarının gaz kromatografi- kütle spektrometresi (GC-MS) ile izovalerik asidemiyi tanımlamalarıyla birlikte cihaz metabolik hastalıkların tanısında kullanılmaya başlamıştır (13). 1980’li yıllarda tandem kütle spektrometresi (TMS) geliştirilmiş ve birçok alanda kullanıma sunulmuştur. Günümüzde LC-MS/MS’in tıp alanında kullanımı gittikçe artan bir öneme sahiptir. Yüksek hassasiyeti ve güvenilirliği, analiz süresinin kısa olması ve bilgisayar kontrollü programlar sayesinde, kütle spektrometreleri artık birçok hastalığın tanısına yaklaşımda son derece kuvvetli bir analitik teknik haline gelmiştir.

25-OH-vitamin D (25(OH)D)’nin klinik olarak doğru ölçülmesi çok büyük önem arz etmektedir. Bunun için bir standartlaştırma gerekmektedir. DEQAS (Vitamin D External Quality Assessment Scheme) sonuçlarına göre; serum 25-OHD düzeylerinde ölçüm metodlarına bağlı olarak laboratuvarlar arası değişkenlikler mevcuttur. Bu değişkenliklerin nedeni; molekülün hidrofobik ve lipofilik yapısının matriks etkisine yol açması, D Vitamini Bağlayıcı Protein (DBP)’e güçlü şekilde bağlanması nedeniyle deproteinizasyon prosedürleri gerektirmesi, dolaşımda çok düşük konsantrasyonlarda (nanomolar) olmaları ve D2 ve D3’ün benzer yapısal özelliklerinin metadolojik problemlere neden olmasıdır (14,15).

Yakın zamana kadar vitamin D ölçümünde kabul edilmiş bir referans yöntem prosedürü (RMP) mevcut değildi. LC-MS/MS yöntemi ve metodolojisi üzerine yapılan çalışmalar ve 2010 yılında Tai ve arkadaşları tarafından geliştirilen aday referans metod çalışması sonucunda, LC-MS/ MS ile vit D ölçümü Joint Comittee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) tarafından “referans metod” olarak kabul görmüştür (16.17). Ayrıca US National Institute of Standards and Technologies (NIST), 25(OH)D3 ve 25(OH)D2 içeren etanol bazlı iki kalibratör standard referans materyal (SRM 2972) ve RMP olarak ortaya konan LC-MS/MS ile değerleri belirlenmiş olan dört adet serum bazlı standart referans materyelini de (SRM 972) kullanıma sunmuştur. Bunun sonucunda yöntemler arası uyumu en çok etkileyen sorunlardan biri olan kalibrasyon sorununun ortadan kalkması öngörülmüştür (18,19,20). Referans bir yöntem ve sertifikalı referans malzemelerin kullanımı ölçüm yöntemlerinin standardizasyonu ve karşılaştırılabilirliğini sağlayacaktır. Günümüzde, NIST (National Institute of Standardsand Technology) standard referans materyali (SRM) ve referans ölçüm prosedürlerinin kullanıma girmesi ile laboratuvarlar arası ölçüm değişkenliği giderek azalmaktadır.

Vitamin D ölçümünde ilk kullanılan ölçüm yöntemi 1971’de bildirilen Vitamin D binding protein’nin bağlayıcı olduğu kompetitif protein bağlama yöntemidir (21). Yöntemin avantajı DBP’nin 25(OH)D2 ile 25 (OH)D3’ü eşit olarak tanımasıdır. Yöntemin kısıtlılığı ise ölçümde 24,25(OH) 2D, 25,26 (OH) 2D, 23- Lactone gibi diğer polar vitamin D metabolitlerini de kapsaması ve 10 gün gibi uzun inkübasyon süresinin olmasıdır. Ancak Silisik asit kromotografisinin kullanıldığı kompetitif protein bağlama yöntemi geliştirilerek inkübasyon süresi 1 saate düşürülmüştür (21-23).

1977’de High Performance Liquid Chromotography (HPLC) geliştirilmiştir. Bu yöntemde UV absorbsiyon yolu ile ölçüm yapılmaktadır. Yöntemin avantajları; interferans veren lipidlerin ve vitamin D metabolitlerinin uzaklaştırması, 25(OH)D2 ve 25(OH)D3’i ayrı ayrı ölçebilmesi, stabil, spesifik, cost-effective ve tekrarlanabilirliğinin yüksek olmasıdır (21,23). Yöntemin dezavantajları ise iyi bir donanım ve deneyim gerektirmesi, ekipman maliyeti ve numune miktarının fazla olması, hazırlayıcı kromatografi gerektirmesi, interferans yapıcı UV bileşiklerden etkilenebilmesi ve test sonuçlanma sürensinin uzun olmasıdır.

1985’te RIA (Diasorin) geliştirilmiştir. Bu yöntem için örnek saflaştırması gerekli olmamaktadır. Bu yöntemin uygulaması kolay ve sonuçları HPLC ölçümü ile koreledir. Hızlı, ucuz ve doğru yöntemlerdir. İnterferansları yoktur ve numune miktarı azdır. Ancak radyoaktif ve kimyasal atık oluşturmaları, 24,25(OH)D3, 24,25(OH)D2 ve 25(OH) D3-26,23-lactone gibi polar vitamin D metabolitleri ile çapraz reaksiyon vermesi ölçümlerin %10-20 daha yüksek verilmesine neden olmaktadır. RIA (IDS) yöntemi ise 25(OH)D3’e %100, 25(OH) D2’ye %75 spesifiktir (21, 23, 24).

ELISA yöntemi RIA ve Kompetitif protein bağlama ölçümdeki gibi diğer polar vitamin D metabolitlerini de kapsamaktadır (24,25(OH) 2D, 25,26(OH) 2D, 23-lactone) (21)

Tüm dünyada artan vitamin D test sayıları laboratuvarları daha basit ve hızlı sonuç veren kemiluminesans yöntemleri kullanmaya yöneltmiş olsa da, bu yöntemlerinde birtakım dezavantajları mevcuttur (Tablo 2);

Son yıllarda “altın standard yöntem” olarak kabul edilen LC-MS/MS, internal standard kullanılmasından ve metadolojiden dolayı daha doğru ve kesin sonuçlar vermektedir. LC-MS/MS yöntemi, 25-OH-vitamin D3 (25(OH)D3) ve 25-OH-vitamin D2 (25(OH)D2) vitaminlerinin serum veya plazmada ekstraksiyondan sonra kantitatif olarak ölçülmesine dayanır. Bu da özellikle tedavilerinde D2 vitamini kullanılan hastalarda doğru sonuç elde etmek ve tedavinin takibi açısından önemlidir.

Ayrıca 2004 yılında Kamao ve arkadaşları tarafından 25- (OH)D’nin izomerizasyon sonrasında 3-epi-25-(OH)D epimerini oluşturduğu tespit edilmiştir (25). Bu epimer bebekler ve özellikle bir yaşından küçük çocuklarada 25- (OH)D düzeyinin önemli bir kısmını oluşturmaktadır (26). Vitamin D düzeylerinin doğru bir şekilde belirlenebilmesi için bu epimerik formların birbirinden ayırdedilmesi gerekmektedir. LC-MS/MS kullanılarak bu epimerik formun kromatografik olarak ayrımı mümkündür.

2012 Yılında Farrell J. ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada (27), randomize seçilen 170 hasta örneği uygun şartlarda bölünerek saklanmış ve bu örneklerden;

• 2 farklı LC-MS/MS yöntemi
• DEA
• 5 farklı İmmunoassay (CLIA) kullanılarak
  – Düşük ve yüksek serum havuzu hazırlanmış
  – Her yöntem 5 tekrarlı 5 gün çalışılmıştır.

Çalışmadan elde edilen verilere göre farklı yöntemlerin korelasyon katsayısı, pearson precision ve bias korelasyon açısından değerlendirilmesi sonucu Tablo 3’de, precision çalışması ise Tablo 4’de özetlenmiştir. Bu sonuçlara göre LC-MS/MS ile yapılan ölçümlerde gün içi ve günler arası %CV’lerin düşük, presizyonun ise yüksek olduğu görülmektedir.

Sonuç olarak;

• Son yıllardaki çalışmalar Vitamin D’nin mineral metabolizması dışında ikincil etkilerinin önemi üzerinde yoğunlaşmaktadır.
• Vitamin D’nin otoimmun hastalıklar, kanser, enfeksiyon ve kardiyovasküler mekanizmalar üzerinde koruyucu ve önleyici bir etkisi olduğunu düşündürmektedir.
• Günümüzde klinik açıdan 25-OH Vitamin D’nin doğru olarak ölçülmesi önemlidir.
• Son dönem yeni jenerasyon yöntemler arasında farklılık 25-OH Vitamin D ölçümünün zor olduğunu göstermiştir.
• Laboratuvarlar 25-OH vitamin D ölçüm metodlarını

1. Doğruluk (Accuracy)
2. Kesinlik
3. Verimlilik
4. Maliyet
5. İş akışlarına göre

Seçmeliler ve mutlaka çok dikkatli bir şekilde metodlarını valide etmelidirler.

• Şüpheli Immunoassay sonuçları mutlaka LCMSMS ile doğrulanmalıdır.

KAYNAKLAR

1.  Holick MF. D Vitamini: D-lightful sağlık perspektifi. Nutr Rev 2008;66: 182-94.

2.  Hyppönen E, Boucher BJ, Berry DJ, Power C. 25-hidroksivitamin D, IGF-1 ve 45 yaşında metabolik sendrom: 1958 İngiliz Doğum Kohortunda kesitsel bir çalışma. Diyabet 2008; 57:298-305.

3.  Wacker M, Holick MF. D Vitamini-İskelet ve İskelet Dışı Sağlık Üzerindeki Etkileri ve Takviye İhtiyacı. nNutrients 2013;5:111-48.

4. Pearce SHS, Cheetham TD. Diagnosis and management of vitamin D deficiency. BMJ 2010;340:b5664.

5. Uçar F, Taşlıpınar MY, Soydaş AÖ, Özcan N. Ankara Etlik İhtisas Eğitim Araştırma Hastanesi’ne Başvuran Hastalarda 25-OH Vitamin D Düzeyleri. Eur J Basic Med Sci 2012;2: 12-5.

6.  Koo WWK, Tsang RC. Kalsiyum ve Magnezyum Homeostazı. İçinde: MacDonald MH, Seshia MMK, Mullet MD, editörler. (2005) Avery’nin Yenidoğanın Neonatoloji Patofizyolojisi ve Yönetimi, 6. baskı. Philadelphia: Lippincott W&W. 847-875.

7. Öngen B, Kabaroğlu C, Parıldar Z. D Vitamini’nin Biyokimyasal ve Laboratuvar Değerlendirmesi. Türk Klinik Biyokimya Dergisi 2008;6:23-31.

8.  Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA, Gordon MC, Hanley DA, Heaney RP ve diğerleri. D Vitamini Eksikliğinin Değerlendirilmesi, Tedavisi ve Önlenmesi: Bir Endokrin Derneği Klinik Uygulama Kılavuzu. J Clin Endocrinol Metab 2011;96:1911-30.

9.  Bringhurst FR, Demay MB, Krane SM, Kronenberg HM. Sağlıkta ve Hastalıkta Kemik ve Mineral Metabolizması. İçinde: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, editörler. Harrison’ın İç Hastalıkları İlkeleri. 16. baskı. New York:MCGraw-Hill Şirketleri; 2005.s. 2238-86.

10.  Lehrer M. Kaplan LA’da. Kütle spektrometresi.St. Louis: Mosby Şirketi, 1996; 167-84.

11.  Hochstrasser DF, Sanchez JC, Appel RD. Proteomik ve doğanın karmaşıklığıyla yüzleşen eğilimleri. Proteomik 2002; 2:807-12.

12.  Andersen BD, Bilge BL. Klinik kimya ders kitabı. Philadelphia: WB Saunders Şirketi, 1986; 197-208.

 

Diğer Bilimsel Bültenlerimizi Okumak İçin Tıklayabilirsiniz. 

Mobil Sağlık Hizmetimizden Yararlanmak İçin Tıklayabilirsiniz.