CMV İnfeksiyonlarının Tanısı – 26.11.2015

CMV infeksiyonu normal bireylerde genellikle klinik belirti vermeden geçirilir. Primer infeksiyon sonrası virus vücutta latent olarak kalır, immun sistemde zayıflama halinde replike olmaya başlar. CMV, aynı zamanda en sık görülen konjenital infeksiyon nedenidir. Bu nedenlerle özellikle immunsuprese hastalarda ve gebelerde CMV infeksiyonlarının laboratuvar tanısı önem taşımaktadır. Laboratuvar tanı için geliştirilmiş yöntemler arasında serolojik yöntemlerle özgül antikorların saptanması, moleküler testlerle viral nükleik asitlerin saptanması, CMV antijenemi testi yer almaktadır. Kantitatif PCR ile viral yük saptanması, tanıda olduğu kadar tedaviye yanıtın takibinde de oldukça duyarlı ve hızlı sonuç veren bir yöntemdir.

CMV İNFEKSİYONLARININ TANISI

Sitomegaloviruslar (CMV) (Human Herpes Virus 5=HHV 5) herpesvirus ailesinin beta herpes virus grubunda bulunurlar.

CMV infeksiyonu tüm dünyada yaygın olup, genellikle çocukluk ve genç erişkin yaş grubunda geçirilmektedir. Bu viruslar insandan insana yayılıp latent (sessiz) infeksiyonlara neden olurlar. (1,2)

CMV‘yi çevreleyen zarf, glikoproteinlerden oluşur. Nötralizan antikorlar bu glikoproteinleri hedef alır. Zarf ve iç kapsid proteinleri konağın hücresel yanıtının hedefini oluştururlar. Bu proteinlerin en önemlisi pp65‘dir. Yapısal pp65 ve pp150 proteinleri ciddi immun yanıta yol açar. CMV konağı infekte ettiğinde olgun CMV pp65 proteini virionla taşınır. Böylelikle viral proteinler sentez edilmeden konağın bağışıklık sistemince tanınır. pp65 en çok yapılan proteindir. CMV ile infekte hücrelerin sitoplazmasında biriken bulaşıcılık özelliği olmayan cisimciklerin önemli bir bölümü pp65‘dir. (3)

CMV tipik nükleer ve sitoplazmik inklüzyon cisimcikleri oluşturur. CMV infeksiyonunda sitomegalik inklüzyon cisimcikleri çok önemli göstergelerdir. Bunlar genişlemiş hücreler olup baykuş gözüne benzerler. Ancak aktif infeksiyon sırasında bu hücrelere rastlanmayabilir. (3)

EPİDEMİYOLOJİ (1,2)

  • CMV‘nin tek rezervuarı insandır.
  • İnfekte kişilerde virus orofarinks salgıları, idrar, servikal ve vaginal salgılar, semen, anne sütü, gözyaşı, dışkı ve kanda bulunur.
  • Primer infeksiyondan sonra uzun süreli ve aralıklı virus ekskresyonu, duyarlı toplum içinde yayılmaya neden olur.
  • CMV infeksiyonu endemiktir, kötü sosyoekonomik koşullar yüksek infeksiyon oranlarına sebep olur.
  • Kötü hijyen koşulları yanında toplum içi yakın temas da infeksiyon için yüksek risk oluşturmaktadır.
  • Ülkemizde CMV infeksiyonu yaygın olarak bulunmaktadır.

 

CMV’NİN OLUŞTURDUĞU HASTALIKLAR VE KLİNİK BULGULAR (1,2)

CMV infeksiyonu: Klinik belirti ya da organ hasarı olmaksızın dokuda veya vücut sıvısında CMV‘nin aktif replikasyonunun gösterilmesi (3).

CMV viremisi: İnfeksiyöz virüsün çevre kanında lökositler içinde taşınmas (3).

CMV hastalığı: CMV infeksiyonu ile birlikte klinik belirti ve/veya organ hasarı olması (3).

Klinik belirtiler: Kırıklık, ateş, lökopeni, atipik lenfositoz, trombositopeni, hafif-orta derecede serum aminotransferaz düzeyinde artış (1,2,3).

Organ hasarı: En sık gelişen CMV hastalığı pnömonidir. %30-50 oranında ölüm riski vardır. Daha nadiren yaygın olarak sindirim kanalında ülserler ve retinit görülebilir (1,2,3).

NORMAL KONAKTA

  • Genellikle klinik belirti vermez.
  • Nadiren ateş, kas ağrıları, nonspesifik şikayetler ve servikal lenfadenopatiyle seyreden mononükleozis sendromuna yol açabilir.
  • Mononükleozis sendromu görülen olguların %8‘inden CMV sorumludur.
  • Olguların çok az bir kısmında hepatit, Guillain-Barre Sendromu, aseptik menenjit ve otoantikorlarla ilişkili bazı immünolojik bozukluklar görülebilir.
  • Hastalık kısa sürede kendiliğinden iyileşir, fakat vücut sıvılarından (idrar, kan ,tükrük, semen, servikal sekresyon ve süt) virus salgılanması uzun süre devam eder.
  • CMV, infekte vücut sıvılarından bulaşır (aynı ortamda yaşayanlar ya da çocuk yuvalarında infekte sıvılara temas eden ellerden ağıza bulaşması ile).
  • CMV infeksiyonu kişi asemptomatik olsa da CMV bulaştırabilir.
  • Primer infeksiyon sonrası virus vücutta latent olarak kalmakta ve viral replikasyon immun sistem tarafından kontrol altında tutulmaktadır.
  • Vücutta bir hasar ya da hastalığa yol açmadan latent kalan virus, immun sistemde zayıflama halinde replike olmaya başlamaktadır.

KONJENİTAL İNFEKSİYON

CMV en sık görülen konjenital infeksiyon nedenidir. İntrauterin infeksiyonda en önemli risk annenin primer veya rekürren (tekrarlayan) infeksiyonudur. Gebelik esnasında geçirilen primer CMV infeksiyonu % 35-50 oranında fetusun infeksiyonu ile sonlanır. Bu annelerden %8-10 oranında klinik olarak belirti veren bebek doğmaktadır. Rekürren infeksiyonda fetal infeksiyon riski %0.2-2 oranındadır. Bu bebeklerde hepatosplenomegali, trombositopeni, peteşiler, mikrosefali, koryoretinit ve hepatit ile karakterize tablolar görülmektedir. Klinik tablonun ağırlığı bebeği infekte eden virusun miktarı, virulansı ve gebeliğin dönemi ile ilişkilidir. İlk trimesterdeki infeksiyonlar fetusu daha yüksek oranda etkilemektedir, buna karşın son trimesterdeki infeksiyonlarda bebekte
daha fazla harabiyet oluşmaktadır. Nörolojik harabiyet kalıcıdır ve yaşamın ileri dönemlerinde sekellerle ortaya çıkar. En sık çeşitli derecelerde işitme kaybı görülmektedir. Koryoretinit de bir diğer geç nörolojik sekeldir. Konjenital infeksiyonda mortalite %11-20 arasındadır. CMV ile konjenital infekte bebeklerde virusun replikasyonu, klinik tablodan bağımsız olarak devam eder. Doğum sırasında veya neonatal dönemde infekte olan bebeklerin vücut sıvılarında yıllarca çok miktarda virus bulunur. Bu da infeksiyonun yayılması açısından önemlidir.

ORGAN ALICILARINDAKİ İNFEKSİYONLAR

Bu grup olgularda transplantasyon sonrası dönemde CMV infeksiyonunu etkileyen faktörler; hastanın ve vericinin serolojik durumu, uygulanan immunosupresyonun derecesi ve tipi, allograft kaynağı, alıcı ve vericinin HLA uyumu ile kullanılan kan ürünü miktarı ve cinsidir. CMV infeksiyonu transplantasyon sonrası dönemde en sık sorun olan infeksiyondur. Hastalığın belirtileri uygulanan immunsupresyonun derecesi ile ilişkilidir. Seropozitif donörden organ alan seronegatif olgular primer infeksiyon riski taşırlar ve yüksek viremi düzeyleri ile seyreden ağır hastalık tablosu oluştururlar. Bu olgularda infeksiyon kaynağı sıklıkla nakledilen organdır. Seropozitif alıcılarda transplantasyon sonrasında immun sistemin baskılanması CMV replikasyonunun artmasına
ve aktif infeksiyona yol açmaktadır. (Reaktivasyon veya reinfeksiyon) Virus kan yolu ile (viremi) yayılarak çeşitli organlara ulaşmakta ve bu organlarda direkt invazyon yaparak hasara neden olmaktadır. (pnömoni, ensefalit, enterokolit, retinit gibi) Virusun immunosupresif etkisine bağlı olarak CMV ile birlikte diğer fırsatçı infeksiyonların gelişme olasılığı da fazladır. Seronegatif vericiden organ alan seronegatif alıcılarda %0-20 oranında primer CMV infeksiyonu bildirilmiştir. Bu grup olgularda kullanılan kan ürünlerindeki lökositler infeksiyon kaynağını oluşturmaktadır. Lökosit içermeyen veya lökosit içeriği azaltılmış kan ürünleri kullanımı ile infeksiyon riski azaltılabilmektedir. Böbrek transplantlı olgularda CMV infeksiyonu glomerulopati yapması nedeniyle greft ömrünü kısaltmaktadır. Karaciğer transplantasyonunda ise CMV infeksiyonu safra kanalı stenozuna neden olmaktadır. Solid organ transplantasyonundan sonra gelişen CMV infeksiyonunda klinik tablo; üç günden fazla süren nedeni saptanamayan ateş, lökopeni, trombositopeni, atipik lenfositoz, transaminazlarda yükselme ile karakterizedir. Perfore olan ağır gastrointestinal infeksiyonlar, hepatit ve pnömoni yaşamı tehdit edebilir.

KEMİK İLİĞİ (Kİ) ALICILARINDAKİ İNFEKSİYONLAR

CMV‘nin allojenik Kİ alıcılarındaki infeksiyonları hem yüksek mortalitesi, hem de graft versus host hastalığı (GVHH) ile ilişkisi nedeniyle büyük önem taşımaktadır. Otolog Kİ transplantasyonu yapılan olgular ise solid organ transplantasyonu olguları kadar risk taşırlar. Allojenik Kİ alıcılarında CMV infeksiyonu %30-70 oranında görülür ve bu hastalarda en çok ölüme neden olan infeksiyondur. Seronegatif vericiden seronegatif alıcıya yapılan Kİ transplantasyonlarında CMV infeksiyonunun kaynağı kullanılan kan ürünleridir. Bu grup hastalarda taranmış ve lökosit içeriği azaltılmış ürünlerin kullanılması gerekmektedir. GVHH ile birlikte en sık görülen infeksiyon CMV pnömonisidir. Kİ transplantasyonundan sonra CMV‘ye bağlı en sık görülen infeksiyon CMV pnömonisidir. Sinsi ilerleyen interstisyel pnömoni şeklinde dir, sıklıkla ikinci ayda görülür. Tedavi uygulanmazsa mortalitesi %80 kadardır. Kİ alıcılarında CMV ile gastrointestinal tutulum da sıklıkla görülür.

HIV İLE İNFEKTE HASTALARDAKİ İNFEKSİYONLAR

CMV, HIV ile infekte kişilerde fırsatçı bir infeksiyon etkeni olmasının yanısıra, HIV infeksiyonunun doğal seyrini bozmakta ve AIDS‘e geçişi hızlandıran bir faktör olmaktadır.

CD4+ hücre sayısı 50/mm³‘ün altında olanlarda CMV insidansı artmaktadır.

HIV ile infekte olgularda CMV her sistemi tutabilir. En sık gastrointestinal sistem, akciğer ve merkezi sinir sistemi tutulumu görülür. Retina tutulumu sonucu bilateral retinit hemoraji ve dekolman komplikasyonları ile tam görme kaybına yol açar.

HIV ile enfekte olgularda CMV ensefaliti de görülebilir.

CMV İNFEKSİYONLARININ LABORATUVAR TANISI (1,2,4,5)

1- Serolojik yöntemlerle özgül antikorların saptanması

Esas olarak ELISA temelli testlerle serumda IgM ve IgG türü özgül antikorlar saptanabilir. CMV IgM antikoru aktif infeksiyonun gösterilmesinde önemlidir. Ancak primer infeksiyondan sonra uzun bir dönem IgM pozitifliği saptanabilir. Bunun yanında IgM sınıfı antikorlar primer infeksiyon ve reaktivasyonlarda pozitif saptanabilmektedir. Virusun gB, pp150 ve pp52 proteinleri ile HSV, EBV ve HHV-6‘nın homolog proteinleri arasında çapraz reaksiyonlar gösterilmiştir.

2- Virusun izolasyonu (Hücre Kültürü)

Primer insan ve şempanze embriyonik fibroblast (deri ve akciğer) hücrelerinde üreyebilir. Viral replikasyon sitopatik etkinin gözlenmesi ile değerlendirilir.

Kültür, altın standart yöntem olarak değerini korumaktadır. Kültürün negatif olarak değerlendirilebilmesi için 28. güne kadar beklenmesi gerektiğinden erken tanıda faydalı olamamaktadır. Viral kültürün hızlı formu olan Shell vial yöntemi ile 24 saat içinde viral replikasyon saptanabilmektedir.

3- Viral nükleik asitlerin saptanması (Kalitatif ve kantitatif PCR ile DNA tayini)

CMV infeksiyonlarının tanısında viral nükleik asit saptamaya yönelik moleküler testler son yıllarda daha çok kullanılmaya başlanmıştır. Moleküler testler CMV infeksiyonunu saptamada antijenemi testi ve hücre kültürlerinden daha duyarlıdır ve CMV infeksiyonunu daha erken dönemde saptayabilmektedir. Viral nükleik asidin amplifiye edildiği PCR yöntemiyle klinik örneklerde (kan, idrar, BOS, BAL, amniyon sıvısı ve oküler sıvılar gibi) viral DNA veya virusa ait mRNA dizileri çoğaltılarak saptanabilmektedir.

PCR yönteminin yüksek duyarlılığı nedeniyle seropozitif kişilerde latent virusun saptanmasına yol açabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Bu nedenle kantitatif PCR ile viral yük izleminin daha doğru bir yaklaşım olduğu belirtilmektedir. Kantitatif PCR ile ayrıca tedaviye yanıt da takip edilebilmektedir. CMV hastalığı gelişenlerde gelişmeyenlere göre viral yük artışının daha fazla olduğu, tedavi başlananlarda viral yükün azalarak belirli bir süre sonunda negatifleştiği belirtilmektedir.

4- Viral proteinlerin saptanması (CMV antijenemi testi)

Bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısı, periferik kan polimorfonükleer lökositler (PMNL) gibi örneklerde monoklonal antikorlar kullanılarak virusun pp65 proteinini araştıran testlerdir. PMNL‘lerde pp65‘in gösterilmesi ‚‘CMV antijenemi testi‘‘ olarak adlandırılır ve viral yükü göstermesi nedeniyle özellikle organ transplantasyonu olgularında invaziv hastalık göstergesi olarak kullanılmaktadır. CMV antijenemi testi solid organ ve kemik iliği transplant alıcıları ve HIV ile infekte hastaların kan lökositlerinde CMV‘nin saptanması ve kantite edilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu hastalarda antiviral tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi ve preemptif tedavi başlanmasında da yardımcıdır. CMV antijenemi testi; PMNL‘lerde CMV‘nin alt matriks proteini olan fosfoprotein (pp) 65‘i saptamaya yönelik hızlı ve kantitatif sonuç veren bir testtir. Sonuçlar pozitif hücre sayısının incelenen toplam PMNL sayısına oranı şeklinde verilmektedir. Antijenemi testinin duyarlılığı hücre kültürlerinden daha yüksektir ve CMV infeksiyonunu daha erken dönemde saptayabilmektedir. Yüksek antijenemi düzeyleri hastalık gelişimi göstergesidir. Düşük antijenemi düzeyleri genellikle asemptomatik infeksiyon ile ilişkilidir.

ÖZEL GRUPLARDA CMV
İNFEKSİYONLARININ TANISI (1,2,4,5)

1- İmmünokompetan erişkinler

Primer infeksiyonun tanısı özgül IgM yanıtı veya serokonversiyonun gösterilmesine dayanmaktadır. Primer infeksiyon sonrası IgM pozitifliği 16-20 hafta sürebilir. Nadir olarak reaktivasyonlarda da IgM pozitifliği saptanabilir.

2- Konjenital infeksiyon

Tanı için yaşamın ilk iki haftasında alınan örneklerde virus ekskresyonunun veya viral nükleik asitlerin gösterilmesi intrauterin infeksiyon tanısında önemlidir. Perinatal infeksiyon tanısı için 4. haftadan sonra başlayan virus ekskresyonunun gösterilmesi gerekir. Virus kültürü için idrar veya tükrük kullanılır. Kordon kanında IgM türü antikorların saptanması da oldukça duyarlıdır. Fakat kordon kanında romatoid faktörün fazla miktarda bulunması yalancı pozitifliklere yol açtığından sonuçların
değerlendirilmesinde güçlük yaratabilir. Konjenital infeksiyon tanısı için idrarda sitomegalik hücrelerin gösterilmesinden de yararlanılmaktadır. CMV IgM antikorları plasentadan geçmediğinden aktif infeksiyonun gösterilmesinde önemlidir.

CMV IgG Avidite Testi: Özellikle gebelik sırasında serokonversiyon net bir biçimde gösterilemiyorsa (CMV IgG ve / veya IgM pozitif bulunan gebelerde) infeksiyon başlangıç tarihini daha net olarak belirleyebilmek için CMV IgG avidite testi yapılır. Avidite, infeksiyon süresi boyunca progresif olarak artar. Yüksek avidite tesbiti 3 aydan daha uzun bir süre önceye dayanan primer infeksiyonu gösterir.

3- Organ transplantasyonu alıcıları

Bu hasta grubunda serolojik testlerin kullanımı transplantasyon öncesi donör ve alıcının serolojik durumlarının belirlenmesi ile sınırlıdır. Serolojik testler invaziv hastalık ve infeksiyonu ayırmada yetersiz kalmaktadır. IgM türü antikorların saptanması aktif infeksiyonu göstermede yetersiz kalmaktadır; çünkü birçok hastada transplantasyon sonrası invaziv hastalık olmadan da IgM pozitifliği görülebilmektedir. Hatta ağır immünosupresyon nedeniyle invaziv hastalık varlığında IgM yanıtı görülmeyebilir.
Transplantasyon sonrası birçok hastada virus ekskresyonu görüldüğünden idrar veya tükrükte virusun gösterilmesi anlamsızdır. Fakat klinik örneklerde (BAL, biyopsi örnekleri, kan) virusun gösterilmesi invaziv hastalığı işaret eder. Transplantasyon sonrası klinik açıdan önemli CMV infeksiyonu, viremi ve/veya organ tutulumu ile karakterizedir. Bu nedenle aktif CMV infeksiyonu tanısı en iyi olarak kanda veya ilgili organda hızlı, duyarlı ve özgül testlerle gösterilmesi ile konur. Kantitatif sonuç veren testlerin kullanılması önerilmektedir. Böylelikle tedaviye yanıt ve direncin izlenmesi de mümkün olabilmektedir. Antijenemi testi viral yük artışını da gösterdiği için hastalık riskinin belirlenmesinde çok yardımcıdır. Ayrıca kantitatif uygulanan PCR yöntemi tanıda ve tedavinin takibinde değer taşımaktadır.

4-HIV pozitif olgular

İnvaziv hastalık tanısı için biyopsi örneklerinde virusun gösterilmesi gereklidir. Antijenemi testi hastalık riskini belirlemede yardımcıdır.

 

KAYNAKLAR

1. Bilgiç Altınay, Özacar Tijen. İnsan Sitomegalovirusu. Ustaçelebi Şemsettin Temel ve Klinik Mikrobiyoloji Kitabında. sf. 835

2.
 Hodinka Richard L. İnsan Sitomegalovirusu. In Murray PR, Baron ES, Jorgensen JH, Manual of Clinical Microbiology, 9. baskı, Cilt 2. sf. 1549-1563

3.
 Erkan Arpacı, Sevgi Kalayoğlu Beşışık. Hemapoetik kök hücre nakli ve Sitomegalovirus İnfeksiyonu:Değişen klinik, tanı ve tedavi; İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Dergisi, Cilt 70, Sayı 2, sf. 051-055 2007

4.
 Çolak D, Cytomegalovirus. Ağaçfidan A, Badur S, Türkoğlu S. İnfeksiyon Hastalıklarının Laboratuvar Tanısında Moleküler Yöntemler Kitabında.İstanbul: MGG As Matbaası 2002:161-171

5.
 Dilek Çolak. CMV İnfeksiyonlarının Klinik Mikrobiyolojik Tanısı,Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi AD, Antalya, KLİMİK 2003 XI. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi, www.klimikdergisi.org/
sayilar/69/257-260.pdf

Kistik ekinokokozun Serolojik Tanısı – 25.11.2015

KİSTİK EKİNOKOKKOZ
(KİST HİDATİK) SEROLOJİK TANI

Dünyada E. granulosus’un neden olduğu kist hidatik hastalığı, özellikle tüm Akdeniz ülkelerinde, bazı Avrupa ülkelerinde, Latin Amerika’da, Afrika’da ve Türkiye’de halen endemiktir. Etkensel tanıdaki zorluklar Kistik Ekinokokkoz (CE) tanısında serolojik testlerin önemini arttırmıştır. Kistik ekinokoz tanısında IHA yönteminin kolay uygulanabilir olması, kısa süre içinde sonuç vermesi nedeniyle sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle karaciğer yerleşimli Kistik Ekinokokkoz olgularının tanısında, İmmun Floresan Antikor (IFA) testinin duyarlılığının yapılan çalışmalarda yüksek olması nedeniyle tercih edilebileceği bildirilmektedir. Kist sıvısından izole edilen proteinlerin membrana transferi ile geliştirilen Western Blot (WB) yöntemi ise Kistik Ekinokokkoz olgularında daha kesin tanı koymakla birlikte, hastaların prognozunu belirlemede ve takipte diğer testlere göre daha üstündür.

 

KİSTİK EKİNOKOKKOZ (KİST HİDATİK) SEROLOJİK TANI

İnsan ekinokokların içinde en sık görülen Echinococcus granulosus, (E.g) kist hidatik hastalığın etkeni olan bir sestoddur. Echinococcus granulosus’un gebe halkaları ve yumurtaları ana konak köpeğin dışkısı ile dışarı atılır. İnsan veya doğal ara konak olan
hayvanlar tarafından (koyun, keçi, domuz, deve vb), sindirim veya solunum yoluyla alınır. Bu yumurtalar duedenomda açılır. Barsak duvarından girerek kan dolaşımına geçer ve değişik doku ve organlarda tutunur. En sık yerleştiği organ karaciğer (%50 – %70) başta olmak üzere akciğer (%20 – %30), dalak, böbrek, beyin, kemik, kalp gibi değişik organlara (<%10) yerleşir ve yerleştiği organa göre değişik klinik tablolar oluşturur (1,2).

E. multilocularis, alveolar ekinokokun, E. vogeli polikistik ekinokokun, E. oligarthrus ise çok nadir görülen ekinokok etkenleridir (1).

Dünyada E. granulosus’un neden olduğu kist hidatik hastalığı, özellikle tüm Akdeniz ülkelerinde, bazı Avrupa ülkelerinde, Latin Amerika’da, Afrika’da ve Türkiye’de halen endemiktir (1). Hayvancılığın yaygın olduğu ülkemizde, yapılan çalışmaların verilerine
göre Kistik Ekinokokkozun ortalama seroprevelansı %2.75- %38.57 oranında bildirilmiştir. Mortalite hızı ise %2-4 arasında değişmektedir (3).

E. granulosus’un bulaşma yolları:

1- Enfekte dışkının gıda veya suya bulaşarak sindirim yoluyla alınması.

2- Enfekte toprak veya kumlarla oynayan çoçukların, kirli ellerle oral yoldan alması.

3-
 Köpek tüylerine bulaşmış kistlerin okşanarak eller ile ağıza götürülmesi ile bulaşma.

4-
 Enfekte dışkının toza karışması ile ağız veya solunum yoluyla bulaşma (4,5).

 

Kistik Ekinokokkoz (CE) Tanısı Klinik Bulgular

K.C’e yerleştiği zaman abdominal ağrı, batında dolgunluk hissi, safra kanalı tıkanıklığı oluşturur.

A.C’e yerleştiği zaman göğüs ağrısı, öksürük, hemoptizi oluşturur.

Kist sıvısı dışarı sızması ile ateş, ürtiker, eozinofili, hipotansiyon, anaflaktik şok tablosuna neden olur (1).

Radyolojik Bulgular

Ultrasound, CT, MR da kistik yapıların görülmesi (1)

Kistik Ekinokokkozun parazitolojik tanısı

Ameliyat veya ince iğne biyopsisi gibi yollarla elde edilen kist sıvılarında, kroşe ve skolekslerin makroskopik ve mikroskopik incelenmesi (6).

Casoni cilt testi

İlk kez 1912 yılında Casoni tarafından kullanılan, intradermal uygulanan bu cilt testi, Kistik Ekinokokkoz hastalarda %56-65 oranıda pozitif bulunmaktadır. Günümüzde terk edilen bu test kişiyi duyarlı hale getirebilir ve bu kişi sonraki serolojik testlerde yalancı pozitif yanıt verebilir (2).

Kistik Ekinokokkoz (CE) Serolojik Tanısı

CE hastalığın tanısında, kiste ponksiyon yapılarak etkensel tanı gerçekleştirilebilir. Ancak bu işlemden sonra sızabilecek kist sıvısının, anaflaktik şoka veya kist dışına çıkabilecek protoskolekslerin sekonder kist oluşturma riskleri vardır. Etkensel tanıdaki zorluklar CE serolojik tanının önemini arttırmıştır (7).

Belirgin bir klinik tablonun olmaması ve yukarıdaki nedenlerden dolayı araştırmacılar serolojik testlere yönelmişlerdir.

Serolojik testlerin kullanım amaçları

1- Hasta olgularını saptamak

2- Asemptomatik kist taşıyıcılarını belirlemek

3- Toplumdaki yaygınlığını ve varsa kontrol programlarının etkinliğini göstermek (8). E.g, B hücre aktivasyonuna yol açarak IgG, IgM, IgA ve IgE antikor oluşumuna yol açmaktadır. Bu antikor sınıflarından hangisinin ilk oluştuğu tam olarak bilinmese
de IgG antikor yanıtı, IgM, IgA yanıtlarına göre daha sık görülmektedir. A.C. kist hidatikli hastalarda cerrahi rezeksiyon sonrası IgM antikor düzeyleri 4-6 ay içinde, K.C. kist hidatiklerde ise 12 ay içinde normale dönerken, IgG tipi antikorlar serumda daha uzun süre yüksek düzeyde kalmaktadır. IgE tipi antikorlar ise antiparaziter immun yanıtta rol oynayan antikorlardır (5).

Serolojik Tanısı kullanılan Testler

1- İndirekt hemaglütinasyon (IHA) testi:

E. granulosusa karşı oluşan antikorları total olarak saptayan, mikroplaklarda eritrosit aglütinasyonunun değerlendirildiği bir testtir. Antijen ile kaplı koyun eritrositleri hasta serumu ile karşılaşınca çökmekte ve 1:160 titrenin üzeri pozitif olarak değerlendirilmektedir. Duyarlılığı çeşitli çalışmalara göre %80-94, özgüllüğü %90-95 arasında değişmektedir. Kistin lokalizasyonuna göre antikor yanıtının değişikliği, A.C kistlerinde bu serolojik testin duyarlılığının azaldığı bildirilmektedir (9).

2- İndirekt floresan antikor (IFA) testi:

E. granulosusa karşı oluşan IgM ve IgG tipi antikorla rını saptar. Biochip slide alanında kaplı E.g larvaları ile flurosceinle işaretli IgM veya IgG antikorları reaksiyona girer, yeşil floresan verir ve floresan mikroskopta görünür hale gelir. (Şekil 2) 1:100 titrenin
üzeri pozitif olarak değerlendirilmektedir. Duyarlılığı çeşitli çalışmalara göre %52-93, özgüllüğü %90-95 arasında değişmektedir. KC yerleşimli kistlerde duyarlılık %90, AC ise %81 olarak bulunmuştur. Sınır değerlerin diğer yöntemlerle doğrulanması gerektiği bildirilmektedir (7).

3- Enzim-Linked İmmunosorbent Assay (ELISA) testi:

E. granulosusa karşı oluşan IgG tipi antikorları saptar. ELISA plakalarındaki E.g antijeni ile kaplı kuyucuklarda, antikor varlığında renk oluşumu gözlenir. Oluşan rengin şiddeti IgG antikor konsantrasyonu ile doğru orantilıdır. Duyarlılığı çeşitli çalışmalara
göre %72-76, özgüllüğü %86-100 arasında değişmektedir. Kullanılan ekinokok antijenlerinin saflaştırılmasındaki sorunlar nedeniyle duyarlılığı daha düşüktür. Bu test özellikle cysticercosisi olan hastalarda çapraz reaksiyon verdiği bildirilmektedir (10).

4- Western blot (WB) testi:

E. granulosusa karşı oluşan IgG tipi antikorları saptar. Kist sıvısından izole edilen proteinlerin membrana transferi ile WB yöntemi geliştirilmiştir. WB plaklarındaki stripler, nonspesifik antijen p 39, spesifik çapraz reaksiyona neden olan p24/26 ve p16/18 ve
E.g spesifik p7 antijenlerini içerir. (Şekil 3) Enfeksiyondan sonra ilk saptanabilir düzeye ulaşan antikorlardan biri nonspesifik antijen p 39’a karşı oluşan antikorlardır. Kist hidatik olgularında görülmekle birlikte, diğer paraziter hastalıklarda özellikle nörosistiserkoziste Taneia solium tarafından bu bant pozitif olarak saptanır. E.g.kist sıvısında bulunan diğer antijenlerden p24/26 ve p16/18 antijeni, kist hidatik olgularında görülmekle birlikte; sıklıkla E. multilocuraris ve Schistosoma enfeksiyonlarında bu bantlar çapraz reaksiyon nedeniyle pozitif olarak saptanır.

  • Kist hidatikte en spesifik bant, p7 bandıdır ve bu bant pozitif olduğunda serolojik tanıyı koydurur.
  • P7 bandı opere olan ve olmayan hastalarda aktif enfeksiyon açısından önemli bir antijendir.
  • P7 bandı özellikle opere olmuş hastalarda, hastayı izlemek adına önemli bir antijendir.
  • P7 bandı özellikle opere olmamış hastalarda, medikal tedaviyi izlemek adına önemli bir antijendir.

WB tekniği hastaların prognozunu belirlemede diğer serolojik testlere göre daha güvenilir bir yöntemdir (11).

 

Kist hidatik enfeksiyonların tanısında kullanılan serolojik testlerde yalancı pozitif sonuçlar (8)

  • Paraziter enfeksiyonlar (Taneia solium, Taneia saginata, Hynenolepsis nana, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Fasiola hepatica, Schistosoma mansoni, Toxocara canis, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Oncocerca volvolus, Plasmodıum)
  • Kanser (Hodgkin hastalığı, lenfoma, lösemi, multiple myelom, A.C kanseri, hepatosellüler karsinom)
  • Kronik hastalıklar (Tbc, siroz, kollajen doku hastalıkları)

 Kist hidatik enfeksiyonların tanısında kullanılan seroljik testlerde yalancı negatif sonuçlar

  • K.C. dışı organlarda yerleşim (A.C.,dalak, beyin, vb)
  • Kalsifiye ölü kistler
  • Çok az antijen bulunması

Serolojik tanıyı etkileyen faktörler

  • Kullanılan testlerin duyarlılıkları ve özgüllükleri
  • Hastanın antikor yanıt
  • Enfeksiyonun lokalizasyonu

Seroljik tanıda kullanılan testlerin duyarlılık ve özgüllükleri kullanılan antijenin özelliklerine, antijenin elde edildiği konağa, hastanın antikor yanıtına, seçilen yönteme göre değiştiği bildirilmiştir. Kistik ekinokoz tanısında IHA yönteminin kolay uygulanabilir
olması, kısa süre içinde sonuç vermesi ve pahalı laboratuvar gereçleri gerektirmemesi nedeniyle sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle karaciğer yerleşimli Kistik Ekinokokkoz olgularının tanısında, Immun Floresan Antikor (IFA) testinin duyarlılığının
yapılan çalışmalarda yüksek olduğu, kolay uygulanabilir olması, kısa sürede sonuç vermesi nedeniyle tercih edilebileceği bildirilmektedir. Kistik Ekinokokkoz olgularında WB ise daha kesin tanı koymakla birlikte, hastaların prognozunu belirlemede
ve takipte diğer testlere göre daha üstündür.

WB testinde saptanan p7 bantının pozitifliği, aktif enfeksiyonun ve post-op hastaları izlemede önemli bir belirteçtir (12). Sonuç olarak kist hidatik enfeksiyonların serolojik tanısında bir tek testin kullanımı özellikle düşük titrelerde yetersiz kalabilmektedir. Bu
nedenle en az iki testin birlikte kullanılmasının daha güvenilir olacağı, mümkünse bunlardan bir tanesinin WB ile kombinasyonu, duyarlılığı daha çok arttırdığı bilinmekte ve serolojik tanıda önerilmektedir.

KAYNAKLAR

1. King CH, Fairley JK. Eds Mandell GL, Benett JE, Dolin R, In Mandell Douglas and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. Philadelphia, Churchill Livingstone; 2010; 3607-3616.

2.
 Erken HD. Akciğer kist hidatiğinde serolojik testlerin ( spesifik IgE, spesifik Ig G ve indirekt hemaglütinasyon testi) tanısal değeri. Uzmanlık tezi, Sağlık Bakanlığı Yedikule Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma
Hastanesi, İstanbul 2004; 7-11.

3.
 Yazar S, Taylan ÖA, Hökelek M, Polat E, Yılmaz H, Özbilge H. Türkiye’de 2001-2005 yılları arasında kistik Ekinokokkozis. Türkiye Parazitoloji Dergisi, 2008, 32(3); 208-20.

4.
 Demrel F, Dökmen YA, Söğüt A, Tomaç N, Ayın olgusu, Türk pediatri Arşivi,2002; 232-3.

5.
 Akgün S. Echinococcus granülosus’a karşı oluşan antikorların IHA, IFA ve ELISA ile tespiti ve Western Blot ile antikor çeşitliliğinin değelendirilmesi. Uzmanlık tezi, Gaziantep Üniversitesi Tıp si Hastanesi, Gaziantep 2008;18-26.

6.
 Köksal F, Serin MS, Kekeç Y. Sadri YE. İnsan ve hayvan kökenli kist hidatik sıvılarının SPS-PAGE metoduyla analizi ve Westernblot metodunun klinik önemi. Türkiye Parazitoloji Dergisi. 1995;19:221-229.

7.
 Özcel MA, Üner A, Ertuğ S. Immunfl oresans Yöntemi,eds: Özcel MA, Altıntaş N. Parazit Hastalıklarında Tanı. Yayın No:15,İzmir 1997;215.

8.
 Parija SC. A review of some simple immunoassays in the diagnosis of cystic hidatid disease. Acta Tropica 1998; 70:17-24.

9.
 Kuman HA. İndirekt Hemaglütinasyon. Eds Özcel MA, Altıntaş N. Parazit Hastalıklarında Tanı. Türkiye Parazitoloji Derneği. Yayın No:15, İzmir, 1997;193-214.

10.
 Ak M. Enzyme linked immunoabsorbant assay (ELISA) Eds Özcel MA, Altıntaş N. Parazit Hastalıklarında Tanı. Türkiye Parazitoloji Derneği. Yayın No:15, İzmir, 1997;241-60.

11.
 Altıntaş N, Yazar S. Western blot (immunobloting) Eds Özcel MA, Altıntaş N. Parazit Hastalıklarında Tanı. Türkiye Parazitoloji Derneği. Yayın No:15, İzmir, 1997;343-72.

12. Biava MF, Dao A, Fortier B. Laboratory diagnosis of cystic hydatic disease. World J Surg 2001; 25:10-4.

Polikistik Over Sendromunda Anti Mülleryan Hormon – 26.10.2015

POLİKİSTİK OVER SENDROMU TANISINDA Anti-MÜLLERİAN HORMON

Polikistik Over Sendromu (PKOS), gerek etyolojisinin tam açıklanamaması ve gerekse fenotipik çeşitliliği nedeniyle, tanıda zorluklara yol açmaktadır. PKOS tanısı genellikle klinik ve ultrasonografik bulgular gibi, subjektif kriterlere dayanmaktadır. Anti-Müllerian Hormon (AMH) ölçümü, özellikle PKOS tanı ve şiddetinin belirlenmesinde yol gösterir. Özellikle Polikistik over morfolojisini (PKOM) tanımlamak için sensitif ve spesifik bir parametredir. Yapılan çalışmalar, AMH seviyesinin, PKOS tanısı için objektif bir kriter olabileceğini göstermektedir.

 

POLİKİSTİK OVER SENDROMU

Polikistik Over Sendromu, ilk kez 1935 yılında Stein ve Leventhal tarafından, yedi hastadan oluşan bir seride polikistik görünümlü overler ve amenore ile birlikte rapor edilmiştir. Aradan geçen yıllarda önemli gelişmeler kaydedilmiş olmakla birlikte halen sendromun etyopatogenezi ve tanı kriterleri hakkında tartışmalar devam etmektedir (1).

Kronik anovulatuar infertilitenin en sık rastlanan sebebi olan PKOS; multisistemik, reprodüktif ve metabolik bir sendrom olarak tip 2 diyabet, dislipidemi, kardiyovasküler hastalık ve endometrial karsinoma gibi uzun dönem riskleri taşıması nedeniyle günümüzde bir halk sağlığı problemi olarak da ön plana çıkmaktadır. PKOS’ lu kadınlarda gestasyonel diabet, gebeliğin indüklediği hipertansiyon, preeklamsi, komplike doğum ve erken doğum sıklığı da yüksektir (1, 2, 6, 7).

PKOS, klinik olarak hiperandrojenizm bulgularına yol açan bir ovaryal disfonksiyondur. Klinikte, en sık görülen hiperandrojenizm nedeni olan PKOS, gerçekte metabolik bozukluğun overlerdeki yansıması olup, reprodüktif çağdaki kadınlarda heterojen özellikte hiperandrojenizm ve sıklıkla oligo-anovulasyon gibi ovaryal disfonksiyona neden olan ve farklı fenotiplerle ortaya çıkan bir endokrin patolojidir (2, 4).

Günümüzde kabul görmüş ve kullanılan tanı kriterleri, NIH (National Institutes of Health) (1990), Rotterdam (2003) ve AES (Androgen Excess Society) (2006) kriterleridir. Bu tanı kriterlerinin ortak özelliği, ağırlıklı olarak, klinik ve ultrasonografik bulgulara dayanmasıdır. Bu bulgular, hiperandrojenizm (HA), oligo ve/veya anovülasyon (OA) ve polikistik over morfolojisidir (PKOM). Tanı koymak için 2 kriter yeterli olmasına karşın, AES kriterlerinden HA zorunludur (2, 3, 4). NIH’ de ise PKOM’ne bakılmaz.

 

TABLO 1 NIH, ROTTERDAM ve AES’e göre tanı kriterleri (4)

PKOS tanısında, tüm tanı kriterlerinde non-klasik adrenal hiperplazi, androjen salgılayan tümörler, androjen etkili ilaç kullanımı, Cushing sendromu, ağır insulin resistansının varlığı, tiroid disfonksiyonu ve hiperprolaktinemi gibi androjen fazlalığına neden olan hastalıkların dışlanması gerekmektedir (2, 3, 4).

Genelde PKOS tanısında kullanılan bu subjektif kriterlerden başka genel kabul görmüş objektif bir belirteç bulunmamaktadır. Yukarıda açıklandığı gibi genellikle tanı, klinik ve ultrasonografik bulgulara dayanmaktadır. Subjektif olan bu kriterlerden dolayı da PKOS prevalansı %2,2 ile %26 arasında değişiklik göstermektedir (4, 9).

Uzun dönemde yol açtığı sağlık problemleri nedeniyle kısa zamanda tanı koymaya yardımcı güvenilir objektif parametrelere gereksinim olduğu aşikardır. Bu amaçla yapılan çalışmalarda son yıllarda ön plana çıkan parametre AMH’dur. İnfertilitede over rezervinin değerlendirilmesindeki rolünün yanısıra pek çok fenotipi bulunan PKOS olgularında da tanıda kullanabileceği yönünde umut veren çalışmalar yayınlanmıştır (2-13) ve yayınlanmaya devam etmektedir.

ANTİ-MÜLLERİAN HORMON (AMH)

AMH, transforming growth factor familyasından bir glikoprotein olup, Müllerian inhibiting substance (MIS) olarak da isimlendirilir (5, 10).

AMH, erkekte testiste Sertoli hücrelerinde, kadınlarda ise overin granuloza hücrelerinde sentez edilir (5, 6). İlk olarak Sertoli hücrelerinin spesifik proteini olarak ve cinsiyet farklılaşmasında önemli rolü nedeni ile tanımlanmıştır. Fetal testisin Sertoli hücreleri tarafından 8. gebelik haftasından puberteye kadar yüksek düzeyde salgılanan bu glikoproteinin, Müller kanalının gelişimini engellediği vurgulanmıştır. AMH yokluğunda, yani fetal testis olmaması halinde ise Müller kanalı gelişerek, tuba
uterinalar, uterus ve vajina’nın üst kısmı oluşur. Bu nedenle, AMH genital organların gelişiminde önemli bir role sahiptir. Kız çocuklarında, AMH sekresyonu 36. gebelik haftasından başlayarak, menopoza kadar devam eder. Doğum sırasında çok düşüktür, ilk 2-4 yıl içinde minimal bir artış gösterir. Genellikle püberteye kadar salgılanmadığını ifade etmek yanlış olmaz. Yaşam boyunca, kadınlarda AMH düzeyi erkeklerden daha azdır (4, 6, 7, 10). Ooferektomi sonrasında ise 3-5 gün gibi kısa zamanda ölçülemeyecek düzeylere iner (10).

AMH, çapı 6-8 mm.ye kadar olan primer, preantral ve antral foliküllerden salgılanır. Sentezi folikülün granüloza hücrelerinde yapılır. Folikül büyüdükçe AMH sekresyonu azalır, 8 mm den büyük foliküllerden salgılanması çok azdır, 8-10 mm den büyük foliküllerden salgılanmaması dominant folikül seleksiyonu için gereklidir (4).

AMH, foliküler gelişime inhibe edici yönde etki eder. Bu etkisini hem recruitment döneminin başlangıcında ve hem de antral foliküllerin FSH’a karşı sensitivitelerini azaltarak foliküler seleksiyonda rol oynar (şekil-1). Böylece aşırı foliküler recruitmentı ve foliküler gelişimi engelleyerek, folikülogenezde fizyolojik sınırları belirleyici rolü vardır. AMH yokluğunda ise recruitment hızı artarak, primordial folikül rezervinin hızla tükenmesi söz konusu olabilir (4).

ŞEKİL 1 AMH sekresyonu ve etkisi. Primer ve küçük antral foliküllerden salgılanır, folikül büyüdükçe, sekresyonu azalır. AMH, recruitment başlangıcında ve FSH’ın foliküler gelişimi engelleyici yönde etkilidir (4).

AMH-PKOS İLİŞKİSİ

PKOS, gerek etyolojisinin tam açıklanamaması ve gerekse fenotipik çeşitliliği nedeniyle, tanısal zorluk göstermektedir. PKOS tanısı genellikle klinik ve ultrasonografik bulgular gibi, subjektif kriterlere dayanmaktadır.

Öncelikle over reservinin belirlenmesinde kullanılan AMH ölçümlerinin, hiperandrojenizm olgularında normalden daha yüksek olması dikkat çekmiş olup, PKOS tanısında, AMH ölçümlerinin yeri olabileceği düşüncesine yol açmıştır (2, 7, 11).

Literatürde, tüm çalışmalarda, PKOS olgularındaki AMH değeri, kontrol grubuna göre 2-3 kat yüksek olarak bulunmuştur (2-14) (şekil.2). PKOS olgularında ortalama AMH serum değerleri 5.0-8.5 ng/mL arasında değişmektedir (4, 10).

Antral folikül sayısı ile, serum androjen düzeyinin paralel olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde antral folikül sayısı ile, küçük over foliküllerinin belirteci olan AMH arasında da benzer ilişki gösterilmiştir (2, 5, 11, 14).

AMH, folikülogenezde inhibitör rol oynamaktadır, bu da PKOS’da anovülasyon nedenini açıklayabilir. PKOS’da AMH yüksekliğinin anahtarı da budur (13).

AMH değeri arttıkça, PKOS tanısal değeri de artış göstermektedir (7,11). Özellikle LH/FSH oranlarının normal olduğu PKOS olgularında, AMH’nın daha belirleyici olması tanısal değerini artırmaktadır (şekil.3). PKOS’lu kadınlarda
LH artışının olması ve bunun AMH seviyesi ile paralellik göstermesi doğaldır. Ancak AMH düzeyi, LH dan farklı olarak, direkt olarak artmış antral folikül sayısının göstergesi olup, PKOS’da tanısal değer taşımaktadır (9).

PKOS tanı kriterlerinden olan over morfolojisinin USG ile değerlendirilmesinin standardize edilmesi güçtür (2, 9). USG sonuçlarının yorumlanması subjektif nitelikte olup gözlemciler arası değişkenlik gösterebilmektedir. Hedef kitlenin büyük çoğunluğu gençler ve üreme çağındaki kadınlar olup, onlar da bekaret ya da obezite nedenleri ile transvajinal ultrasonografi değerlendirmesi için uygun olmayabilirler. Bundan başka, PKOS’ un farklı fenotipleri, tanıyı daha da zorlaştırmaktadır. AMH seviyesi,
PKOS ve PKOM tanısı için foliküler fazdaki USG ihtiyacını azaltabilir. Diğer taraftan AMH testinin, menstruasyonun herhangi bir gününde ölçülebilmesi ve stabil olması da bir diğer avantajdır (3, 9).

Bir çok çalışmada PKOM ve AMH düzeyi arasında korelasyon tespit edilmiştir (7, 8, 12).

PKOS’da AMH fazlalığının, sadece antral folikül sayısının artışından değil, granuloza hücrelerindeki AMH sekresyonunun artışından da kaynaklandığı gösterilmiştir. Farklı çalışmalarda PKOS’lu kadınlardaki granuloza hücrelerinin sekresyon artışının folliküler sıvıda normale oranla 18-75 kat daha yüksek olduğu gösterilmişir (4, 5, 6, 10).

ŞEKİL 2 PKOS ve kontrol olgularında ortalama AMH
değerleri. PKOS’lu hastalarda ortalama AMH değeri
7,34 ng/ml bulunmuş olup, bu değer PKOS olmayanlarda
2,24 ng/ml olarak bulunmuştur (9).

ŞEKİL 3 AMH persantil değerlerine göre PKOS tanı oranları. Bu grafikte özellikle, LH Ve LH/FSH oranı gibi genellikle
kullanılan değerler normal sınırlarda iken AMH’nun artmış olması dikkat çekicidir. (9)

PKOS’lu hastaların gerek serum ve gerekse foliküler sıvılarındaki artmış AMH düzeyinin anovulasyon etyolojisinde rolü olduğu sanılmaktadır. Bu olgularda immature oosit sayısının artışı söz konusudur (4). Diğer yandan, PKOS’da AMH artışının, folikülogenezin aksaması sonucunda pre-antral ve küçük antral folikül sayısındaki artışın sonucu da olabileceği vurgulanmıştır (10).

AMH’ın PKOS tanısı yanında, PKOS şiddetini belirleme çalışmaları da sürmektedir. Şahmay ve arkadaşlarının 2013’te, 251 hastada 4 temel PKOS fenotipinde çeşitli parametreleri karşılaştırmışlardır ve PKOS şiddeti ile AMH değerinin paralel bir seyir izlediğini tespit etmişlerdir. Buna göre, en yüksek AMH değeri, PKOM+OA+HA olgularda, bu üç kriterden ikisininin bulunduğu olgularda ise daha düşük AMH düzeyi saptamışlardır (7). Bu ve buna benzer çalışmalarda, serum AMH seviyesinin, PKOS’da semptomların ağırlığı ile de paralellik gösterebileceği ileri sürülmüştür (tablo-3) (7, 13, 15).

Folikül sayısı yerine AMH ölçümlerinin, PKOM tanısına yeterli olabileceği vurgulanmaktadır. Bir başka ifadeyle USG yerine AMH ölçümünün kullanılabileceği konusunda pek çok çalışma vardır. Pek çok güncel çalışmada PKOM yerine AMH kullanılabileceği gösterilmiştir (tablo-4) (2, 4).

Bir çok çalışmada PKOS tanısında AMH düzeyi için, sınır değer belirlenmeye çalışılmıştır. Tüm çalışmalarda PKOS’ta artmış AMH seviyeleri bildirilmesine rağmen sınır değerlerindeki tutarsızlığın, hasta sayısı, örnek seçim kriterleri, ırksal özellikler ve PKOS fenotiplerindeki farklılıklardan kaynaklandığı düşünülmektedir (9).

Ancak, son yıllarda PKOS tanısında yapılan benzer çalışmalarda AMH ölçümlerinin hem sensitivite, spesifisite değerleri, hem de sınır değerleri birbirlerine oldukça yakın bulunmuştur.

 

 

Dewailly ve arkadaşları, 2011’de 240 hasta da yaptıkları çalışmada, sınır değerini 5ng/mL saptamışlardır (sensitivite: %92 – spesifite: %97) (2).

Şahmay ve arkadaşları, 2013’de 570 ve 606 hasta içeren farklı iki çalışmaların sırasıyla, AMH sınır değerini 3.8 ng/ml ve 3,94 ng/ml olarak saptamışlardır. Klasik 3 tanı kriterine göre tanı konmuş olgularda AMH değerini kullanarak yeniden değerlendirdiklerinde tanısal gücün önemli ölçüde arttığını da tespit etmişlerdir (tablo-5) (9,12,15). Bir diğer ifade ile, tek başına AMH değeri yerine, AMH ile birlikte OA ve/veya HA kriterleri kullanıldığında PKOS tanısal gücü çok artmaktadır.

Sonuç olarak; PKOS, gerek etyolojisinin tam açıklanamaması ve gerekse fenotipik çeşitliliği nedeniyle, tanıda zorluklara yol açmaktadır. PKOS tanısı genellikle klinik ve ultrasonografik bulgular gibi, subjektif kriterlere dayanmaktadır. AMH ölçümü, PKOS ve PKOM tanısı için foliküler fazdaki ultrasonogarfi ihtiyacını azaltır. Ultrasonografi ile folikül sayısını tespit etmenin dezavantajları da göz önüne alındığında, PKOM ve PKOS’u tanımlamak için AMH sensitif ve spesifik değeri yüksek, bir parametredir. OA ve/veya hiperandrojenizm HA ile kombine edildiğinde tanısal gücü çok artar. Ayrıca klasik bulgular göstermeyen, düşük LH ve LH/FSH oranı olan hastalarda tanıda çok yol göstericidir. PKOS tanı ve şiddetinin belirlenmesinde yol gösterir. AMH seviyesi, PKOS tanısı için objektif bir kriter olabilir. Özellikle PKOS tanısında tereddüt edilen olgularda, infertilite tedavisinde over hiperstimülasyon sendromu gelişim riskinden korunmak için de AMH tek, güvenilir ve çok yol gösterici bir parametredir.

KAYNAKLAR

1. Demir M. Türk Klinik Biyokimya Dergisi 2013; 11(2):79-85.

2.
 Dewailly D, Gronier H, Poncelet E, Robin G, Leroy M, Pigny P, Duhamel A, Catteau-Jonard S. Diagnosis of polycystic ovary syndrome (PCOS): revisiting the threshold values of follicle count on ultrasound and of the serum AMH level for the definition of polycystic ovaries. Hum Reprod. 2011;26: 3123-3129.

3.
 Eilertsen T, Vanky E, Carlsen S. Anti-Mullerian hormone in the diagnosis of polycystic ovary syndrome: can morphologic description be replaced? Hum. Reprod. (2012) 27 (8): 2494-2502.

4.
 Şahmay S. Polikistik over Sendromu ve Anti Müllerian Hormon. 2015>

5.
 Pellatt L, Hanna L, Brincat M, Galea R, Brain H, Whitehead S, Mason H. Granulosa cell production of anti-Mullerian hormone is increased in polycystic ovaries. J Clin Endocrinol Metab 2007;92:240–245.

6.
 Pişkinpaşa Serhan. Yıldız Bülent O. Polikistik Over Sendromu.Hacettepe Tıp Dergisi 2005; 36: 168-174

7.
 Şahmay S. Atakul N, Oncul M, Tuten A, Aydogan B. Serum anti-Mullerian hormone levels in the main phenotypes of polycystic ovary syndrome. 2013; 170(1) : 157-161.

8.
 Homburg R, ray A, Bhide P, Gudi A, Shah A, Timms P, Grayson K. The relationship of serum anti-mullerian hormone with polycystic ovarian morfology and polycystic ovary syndrome: a prospective cohort study. Hum Reprod. 2013;28(4): 1077-1083.

9.
 Sahmay S, Atakul N, Aydogan B, Aydin Y, Imamoglu M, Seyisoglu H. Elevated serum levels of anti-Müllerian hormone can be introduced as a new diagnostic marker for polycystic ovary syndrome. Acta Obstet Gynecol Scand. 2013;92(12):1369-74.

10.
 La Marca A, Broekmans F.J, Volpe A , Fauser B.C, Macklon N.S. Anti-Müllerian hormone (AMH): what do we still need to know? Human Reproduction, 24:2264, 2009

11.
 Yi-Hui Lin. Yi-Hui Lin, Wan-Chun Chiu, Chien-Hua Wu, Chii-Ruey Tzeng, Chun-Sen Hsu, Ming-I Hsu, Antimullerian hormone and polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility.2011;96(1):230-235

12.
 Sahmay S. Aydin Y. Oncul M Senturk L. Diagnosis of Polycystic Ovary Syndrome: AMH in combination with clinical symptoms: J Assist Reprod Genet DOI 10.1007/s10815-013-0149-0

13.
 Pellatt L, Rice S, Mason HD.:. Anti-Müllerian hormone and polycystic ovary syndrome: a mountain too high? Reproduction. 139;825, 2010

14.
 Sahmay S, Demirayak G, Guralp O, Ocal P, Senturk LM, Oral E, Irez T. Serum anti-müllerian hormone, follicle stimulating hormone and antral follicle count measurement cannot predict pregnancy rates in IVF/ICSI cycles. J Assist Reprod Genet. 29:589-95,2012014

15.
 Sahmay S, Aydın Y, Atakul N, Aydogan B, Kaleli S. Relation of antimullerian hormone with the clinical signs of hyperandrogenism and polycystic ovary morphology:Gynecol Endocrinol, 2014; 30(2): 130–134

Vaginal Akıntılara klinik ve Laboratuvar Yaklaşımı – 26.10.2015

Vajinal akıntı kadınlarda sıklıkla hekime başvuru nedeni olan bir yakınmadır. Üreme çağındaki sağlıklı kadınlarda bir miktar vajinal akıntı olması normaldir. Kaşıntı, irritasyon, kızarıklık, ödem ya da koku değişimi ile karakterize olduğunda dikkate alınmalıdır. Vaginal ve servikal infeksiyon etkeni olan mikroorganizmaların saptanmasında klinisyen ve laboratuvar işbirliği çok önemlidir. Doğru bölgeden, doğru örnek alınmalı, uygun koşullarda laboratuvara transport edilmeli, laboratuvar ön tanı hakkında bilgilendirilmeli, uygun tanı testi istenmelidir. Vaginal akıntının değişimine neden olan etkenler mikroskopi, kültür gibi tanı yöntemlerinin yanı sıra antijen testleri, Nükleik Asit Amplifikasyon ve PCR testleri ile de tanımlanabilir.

 

Vajinal akıntı kadınlarda sıklıkla hekime başvuru nedeni olan bir yakınmadır. Üreme çağındaki sağlıklı kadınlarda bir miktar vajinal akıntı olması normaldir. Kaşıntı, irritasyon, kızarıklık, ödem ya da koku değişimi ile karakterize
olduğunda dikkate alınmalıdır (1).

Puberte döneminde başlayan fizyolojik akıntı kokusuz, renksiz veya süt beyazı görünümündedir. Vajinal duvarlara yapışıktır. Servikal mukus, dökülen vajina epitel hücreleri ve laktobasillerden oluşur. Menstrual siklustaki hormonal dalgalanmaların sonucu olarak, servikal mukusun miktarı ve tipi değişir. Ovulasyon öncesinde, östrojen seviyesindeki artışa bağlı olarak servikal mukus kalın, yapışkan infertil formdadır. Ovulasyon döneminde temiz, şeffaf-beyaz, ıslak, uzayan ve kaygan fertil forma dönüşür. Ovulasyon sonrasında ise, östrojen seviyeleri düşer, progesteron seviyesi artar; servikal mukus ince, yapışkan spermin ilerleyişine direnç gösteren bir forma dönüşür (2,3).

Üreme çağındaki sağlıklı kadınlarda normal vajina florasının % 95’ini laktobasiller oluşturur. Prepubertal dönemde difteroid çomaklar ve koagulaz negatif stafilokoklar vajinal floraya hakim iken, puberte ile birlikte östrojen seviyelerindeki artışa bağlı olarak laktobasillerin kolonizasyonu başlar. Laktobasiller dökülen vajinal epitellerdeki glikojeni metabolize ederek laktik asit ve hidrojen peroksit üretilmesini sağlar. Bu da puberte öncesinde fizyolojik olan vajinal pH’nın, üreme çağında 3.5-4.5 olmasını sağlar (3). Üreme çağında vajinal ortamdaki diğer flora üyeleri difteroid çomaklar, koagülaz negatif stafilokoklar, alfa-hemolitik streptokoklar, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus spp., Escherichia coli, Candida spp., Peptostreptococcus spp., Bacteriodes spp, ve Gardnerella vaginalis’dir. Postmenapozal dönemde laktobasillerin hakimiyeti azalır, yerini Enterobacteriaceae ailesine bırakır (4,5).

ÜREME ÇAĞINDAKİ KADINLARDA VAGİNAL AKINTININ DEĞİŞMESİNE NEDEN OLAN ETKENLER

Vajinal akıntı nedenleri infeksiyona bağlı olan ve olmayan nedenler olarak iki temel gruba ayrılabilir:

İNFEKSİYONA BAĞLI NEDENLER

CİNSEL YOLLA BULAŞAN İNFEKSİYON ETKENLERİ

Chlamydia trachomatis:

Chlamydia trachomatis cinsel yolla bulaşan bakteriyel infeksiyonlar arasında en sık (yaklaşık % 70 oranında) rastlanan etkendir. Çoğunlukla asemptomatik seyreder.

Servisit gelişimine bağlı olarak vajinal akıntı, postkoital ya da ara kanama, alt kadran ağrısı görülebilir. Kanama bazen şiddetli olabilir. Endometrit gelişebilir (2).

Neisseria gonorrhoeae:

Neisseria gonorrhoeae kadınların yaklaşık % 50’sinde asemptomatiktir. Primer olarak servisit yapar. En sık rastlanan semptomu artmış ya da değişmiş vajinal akıntı ve alt kadran ağrısıdır. Menstrual kanamanın artışına, postkoital ya da ara menstrual kanamalara neden olabilir. Genital kaşıntı ve dizüri görülebilir. Pelvik inflamatuar hastalığa (PİH) yol açabilir (2).

Trichomonas vaginalis:

 

Trichomonas vaginalis kamçılı bir protozoondur. Vajinal akıntı ve dizüriye neden olur. Üretrit nedeni de olabilir. Diffuz, ağrılı, kötü kokulu, sarı-yeşil akıntı görülür. Vulvada irritasyon ve kaşıntıya neden olur. Muayenede serviksin gergin olduğu, eritamatöz ve eksudatif noktasal alanlar içerdiği gözlenir. Bu bulgu “çilek görünümü” olarak adlandırılır. Polimorfonüklear lökositler (PNL) artmıştır. Her zaman cinsel yolla bulaşan bir etkendir. Yeni cinsel partner değiştiren, ya da birden fazla cinsel partneri olan, cinsel yolla bulaşan hastalık öyküsü olan kişiler daha çok risk altındadır. Trikomoniyazisi olan olgularda Human Immunodeficiency Virus (HIV) kazanımının arttığını gösteren kanıtlar vardır (1,2).

Herpes Simplex Virus:

Herpes simplex virus (HSV) nedeniyle servisit gelişen kadınlarda zaman zaman vajinal akıntı görülebilir (2).

CİNSEL YOLLA BULAŞMAYAN VAJİNAL İNFEKSİYON ETKENLERİ

Bakteriyel vajinozis:

Bakteriyel vajinozis üreme çağındaki kadınlarda anormal vajinal akıntının en sık nedenidir ( yaklaşık % 40-45 oranında). Kaşıntısız, grimsi renkli, akışkan, baskın kötü kokulu (genellikle balık kokusu), çok miktarda akıntı vardır. Vulvar inflamasyon görülmez. Lökositler göreceli olarak azalır. En önemli etken Gardnerella vaginalis’tir. Diğer etkenler Mycoplasma, Ureoplasma, Prevotella ve Mobiluncus türleri olarak bildirilmektedir. Mikst anaerobik floranın laktobasillerin yerine geçmesi, laktik asit üretiminin azalmasına, vajinal pH’nın 4.5’ in üzerine çıkmasına neden olur. pH değerinin yükselmesi, tekrarlayan ataklar gelişmesine neden olabilir.

Vulvovajinal kandidiyazis:

Vulvovajinal kandidiyazis üreme çağındaki kadınlarda sık görülür. Tüm kadınların yaklaşık % 75’ inde en az VAJİNAL AKINTILARA KLİNİK VE LABORATUVAR YAKLAŞIMI 1 defa, % 40-45’inde 2 ya da daha fazla atak görülür. Sağlıklı kadınların % 20-25’inde Candida kolonizasyonu saptanmaktadır. Tipik semptomları vulvada kaşıntı, kızarıklık, vajinal ağrı, disparoni, external dizüridir. Vulvada ödem, fissür, deskuamasyon görülebilir. Akıntı peynir kesiği görünümündedir. En sık etken Candida albicans’ tır (%70-90). Diğer Candida türleri içinde ise en sık görülen C. glabrata (%14)’ dır.

Aerobik vajinit:

 

Bazı kaynaklarda laktobasillerin azaldığı, pH’ nın yükseldiği bazı durumlarda, aerobik flora üyelerinin kolonizasyonunda anormal bir artış gerçekleştiği, bunun da E.coli, S. agalactiae, S. aureus aracılığıyla gelişen infeksiyonlara neden olduğu bildirilmektedir. Bu tablo “aerobik vajinit” olarak tanımlanmaktadır. Mikst infeksiyon sık görülmektedir. Semptomlar ağrı, irritasyon ve akıntıdır. Uzamış klinik semptomlar ve zaman zaman alevlenmeler gözlenmektedir (6,7).

İNFEKSİYONA BAĞLI OLMAYAN VAJİNAL AKINTI NEDENLERİ

Diğer vajinal akıntı nedenleri tampon, rahim içi araç ve kondom gibi yabancı cisimler, servikal ektopi ya da polipler, genital kanal maligniteleri, fistül ve allerjik reaksiyonlardır. Vajinal akıntı yakınmasıyla başvuran hastalarda, fizyolojik vajinal akıntı ya da infeksiyon dışlandıktan sonra, bu sebepler de göz önünde bulundurulmalıdır.

VAJİNAL AKINTISI OLAN HASTAYA YAKLAŞIM

KLİNİK ÖYKÜ

Normal vajinal akıntıdan farklı bir akıntısı olduğunu ifade eden bir kadında öncelikle klinik öykü değerlendirilmelidir. Cinsel davranışlar, vajinal akıntının karakteri, predispozan faktörler açısından ayrıntılı anamnez alınmalıdır.

Cinsel Yaşam:

Cinsel yolla bulaşan hastalıklarda vajinal akıntı çok fazla görülmeyebilir. Ancak akıntıyla başvuran hastalarda, sık cinsel partner değiştirilmesi, cinsel davranışlar, kondom kullanımı gibi durumlar sorgulanmalıdır. Özellikle 25 yaşın altında ya da son 12 ayda birden fazla partner değiştiren, son 12 ayda Chlamydia trachomatis infeksiyonu tanısı konmuş kadınlar cinsel yolla bulaşan infeksiyonlar açısından risk altındadır (2).

Vajinal Akıntının Karakteri:

Vajinal akıntının karakteristiği, akıntının sebebi hakkında
önemli ipuçları verir:
Ne değişti?
Başlangıcı
Süresi
Kokusu
Siklusa göre değişimi
Rengi
Arttıran (ağırlaştıran faktörler;cinsel ilişki gibi..)
Miktarı
Yoğunluğu

Vajinal Akıntıya Eşlik Eden Semptomlar:

Kaşıntı
Disparoni
Vulvar ya da vaginal ağrı
Dizüri
Anormal kanama (artmış, intermenstrual ya da postkoital)
Pelvik ya da abdominal ağrı
Ateş

FİZİK MUAYENE

Tek başına anamnez tanı koymada yeterli olmayabilir. Fizik muayene ve vaginal pH ölçümü de tanıya oldukça yardımcıdır. Ayrıca şüpheli etkene göre, endoservikal kanaldan ya da vajinal duvarlardan sürüntü alınması önerilir.

Fiziksel muayenede;

Vulva inspeksiyonu ile dışarı akan akıntı, vulvada ödem, eritem, ülser varlığı gibi lezyon ve değişiklikler gözlenmelidir.

Spekulum muayenesi ile vajinal duvar, serviks, yabancı cisim inspeksiyonu yapılmalı, akıntının miktarı, yoğunluğu ve kokusu gözlenmelidir.

Abdominal palpasyon ile ağrı ve kitle tespiti yapılmalıdır.

Bimanuel pelvik muayene ile adneksiyal, uterin ağrı/kitle, servikal hareketle gelişen ağrı tespiti yapılmalıdır.

Sık vajinal akıntısı olan kadınlar altta yatan ciddi patolojik durumlar açısından irdelenmelidir (2).

LABORATUVAR YAKLAŞIMI

Hangi örnek, nasıl alınmalı?

Mikrobiyolojik tanı amacıyla incelenecek örneklerden doğru sonuçları elde edebilmek için; uygun alandan seçilmiş, doğru olarak alınmış, değişmemesi sağlanmış ve taşınmış özgül klinik materyal olması gereklidir. İlgili laboratuvarın örnekleri değerlendirmesinde yardımcı olacak bilgi notları oluşturulmalıdır:

Örneğin alındığı bölge
Şüphelenilen infeksiyon etkeni
Sık tekrarlayan semptomlar, başarısız tedavi
Şimdi ya da daha önce olan intrauterin araç
Şimdi ya da yakın zamandaki gebelik
Yakın zamandaki cerrahi girişimler
Yabancı cisimler

Vaginal Sürüntü Örnekleri:

Vajinal sürüntü örnekleri bakteriyel vajinozis, vulvovajinal kandidiyazis, Trichomonas vaginalis ve diğer genital infeksiyonların (streptokokal infeksiyonlar gibi) tanımlanmasında yardımcı olur. Mycoplasma ve Ureoplasma’nın rutin olarak kültürü yapılmaz. Şüpheli olgularda klinisyen tarafından ayrıca istenmeli ve ayrı örnek alınmalıdır (4).

Servikal Örnekler:

Gonore ve Klamidya şüpheli olgularda servikal sürüntü örnekleri alınması önerilmektedir. Klamidya tanısında kültür yerine, Nükleik asit amplifikasyon testleri (NAAT) ya da antijen testleri önerilmektedir (4).

MİKROSKOPİ

Taze preparat ile;

Hareketli Trichomonas vaginalis trofozoidleri,
Tomurcuklanan maya ve psödohif yapıları,
Clue cell
Lökositler değerlendirilebilir.

Mikroskopi ile tanı koymada duyarlılık T.vaginalis için % 70, Candida için % 50, N. gonorrhoeae için % 30-50’ dir.

Taze preperat 10-20 dakika içinde incelenmeli, bu sırada oda ısısında kalmalıdır. T.vaginalis şüpheli olgularda taze preperat duyarlılığı 10 dakikalık gecikmeyle % 20’ ye düşer (8).

Gram preparat ile;

 

Clue cell (epitel hücre duvarlarının çok sayıda Gram labil kokobasiller tarafından istila edildiği morfolojik görünüm),

Bakteri morfolojisi
Maya hücreleri
Lökositler

Lökositler tarafından fagosite edilmiş kahve çekirdeği morfolojisindeki Gram negatif diplokoklar ( Neisseria gonorrhoeae için tipiktir) değerlendirilir.

Normal fizyolojik akıntıda PNL/epitel hücre oranı: 1 olmalıdır. Arttığı durumlar trikomoniyazis, vulvovajinal kandidiyazis, aerobik vajinit lehine, azaldığı durumlar bakteriyel vajinit lehinedir.

Laboratuvar tanısında bakteriyel vajinozisin, tek bir etyolojik ajandan çok, bir grup mikroorganizmanın birlikte etkili olduğu bir sendrom olmasının anlaşılmasıyla, kültürden ziyade mikroskopik inceleme kullanılmaya başlanmıştır. Direkt mikroskobik incelemede “clue cell” saptanmasında yaşanan zorluklar ise, Gram boyalı mikroskobik incelemeyi ön plana çıkarmıştır.

Gram değerlendirme ile;

Clue cell morfolojisi taze preparata göre daha iyi değerlendirilebilir.

Daha objektif bir yöntemdir.

Preparatların saklanabilmesi yorumunun tekrar değerlendirilebilmesini sağlar.

Bu yöntem laboratuvar tanısında standardizasyonu sağlar.

Nugent tarafından tanımlanmış Gram değerlendirmesi bakteriyel vajinozis tanısında altın standart kabul edilmektedir (1-4)

Nugent skorlamasında subjektif bir kriter olan “clue cell” varlığı araştırılmamakta; laktobasillerin, Mobiluncus benzeri Gram negatif kıvrık basillerin, Gardnerella ve bazı anaerop bakterilere karşılık gelen Gram labil ya da Gram negatif kokobasillerin varlığı araştırılmaktadır. (Tablo 1.)

Nugent Skorlaması verilerine göre;

0-3 olan skorlar: Normal

4-6 olan skorlar: Normal floradan mikst anaerop floraya geçiş olduğunu düşündürür. Klinisyenle iletişime geçilerek örnek tekrarı istenir.

7-10 olan skorlar: Bakteriyel vajinozisle uyumludur (9).

 

 

POTASYUM HİDROKSİT( KOH) UYGULANMASI

Whiff (koku) testinde vajinal salgının % 10-20 potasyum hidroksit ile muamelesi sonrası balık kokusu oluşumu bakteriyel vajinozis lehinedir. Mayaların daha iyi görülmesini sağlar.

pH ÖLÇÜMÜ

Bakteriyel vajinoziste pH değerinin >4.5 olması tanıya yardımcıdır. Trikomoniyaziste de >4.5’ tir. Candida infeksiyonlarında pH değişmez.

AMSEL KRİTERLERİ

Bakteriyel vajinozis tanısı için geliştirilmiş Amsel kriterleri fizik muayene ile birlikte pH ve whiff (koku) testi uygulanarak, klinik tanı koyma olanağı sağlamaktadır (10).

Amsel kriterlerine göre;
Homojen gri-beyaz akıntı.
pH ölçümünün >4.5 olması

% 10 potasyum hidroksit ile muamele sonrası balık kokusu oluşumu (whiff test)

Taze preperatta “clue cell” hücrelerinin varlığının gösterilmesi.

Bu 4 kriterden 3’ ünün müspet olması ya da pH>4.5 iken, 2. herhangi bir kriterin varlığı tanıda yeterli bulunmuştur (10).

Ancak klinik kriterlerin subjektif nitelik taşıması ve yeterince özgül olmaması nedeniyle standart laboratuvar tanısına gereksinim duyulmaktadır. Amsel kriterleri ile Nugent skorlamasının kıyaslandığı çalışmalarda, bakteriyel vajinozis tanısında Nugent skorlamasının daha iyi bir belirleyici olduğu sonucuna varılmıştır (11).

KÜLTÜR

Mikroskobik inceleme ile tanı konulamayan Candida şüpheli olgularda ya da Candida tür tanımlanması gerektiren durumlarda kültür önerilmektedir.

T.vaginalis şüpheli olgularda kültür testlerinin % 95’ e varan duyarlılığı vardır. Ancak uzun, pahalı ve zahmetli bir iştir. Tarama amacıyla kullanılması önerilmez.

Günümüzde gonore ve klamidya şüpheli olgularda Nükleik Asit Amplifikasyon Testleri (NAAT)’nin kültür yapmaktan daha duyarlı olduğu bildirilmektedir. NAAT pozitif olgularda antibiyotik duyarlılığını belirlemek amacıyla kültür yapılması önerilmektedir.

Şüpheli olgularda Mycoplasma ve Ureoplasma kültürü klinisyen tarafından ayrıca istenmelidir. Servikal ya da vajinal sürüntü örneklerinde çalışılabilir.

Bakteriyel vajinozis tanısında kültürün yeri yoktur. Duyarlılığı % 94, özgüllüğü % 50-60’dır. Gardnerella vaginalis normal flora da bulunabildiğinden, Gram skorlamasına göre raporlamak daha doğrudur. Gram verileriyle birlikte, yoğun üreme saptandığında raporlanabilir.

S.agalactiae, S.pyogenes, Haemophilus spp., S.aureus, enterik Gram negatif bakteriler, yoğun ve izole üreme olduğunda, lökositlerin artmış olduğu durumlarda, invaziv yöntemlerle alınmış örneklerde raporlanabilir.

Gebelerde Listeria monocytogenes ve Streptococcus agalactiae ürediğinde klinisyene bildirmenin önceliği vardır (4,6,11).

NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ (NAAT)

Nükleik Asit Amplifikasyon Testleri klinik laboratuvarlarda, ilk olarak genital Chlamydia trachomatis ve Neisseria gonorrhoeae infeksiyonlarının tanısında kullanılmaya başlanmış, daha sonra diğer etkenler için de geliştirilmiştir. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Ureoplasma urealyticum/parvum, Herpes simplex virus1/2, Mycoplasma hominis ‘ in bir arada araştırıldığı paneller bulunmaktadır. Bu yöntem ile genomik DNA’ lar real-time PCR ile saptanmaktadır. Yapılan klinik değerlendirmeler bu testlerin kültür, antijen tespiti ve nükleik asit hibridizasyon testlerinden daha duyarlı olduğunu göstermektedir. Duyarlılığı % 95, özgüllüğü % 99.5 olarak bildirilmektedir. Bu testler altın standardın tanımlanmasında kültüre alternatif olmuş ve bununla ilgili yeni protokoller belirlenmiştir. Servikal infeksiyonu olan, seksüel aktif, birden çok ya da yeni cinsel partneri olan, gebe, tekrarlayan ve kronik servisiti olan kadınlarda tanı koymada ilk seçenek olarak önerilmektedir. Pekçok etkenin aynı anda araştırılabilmesi, hızlı sonuç verebilmesi, transport koşullarından etkilenmemesi önemli avantajlarıdır. Servikal sürüntü, üretral sürüntü, idrar ve hastanın kendi aldığı vajinal sürüntü örneklerinde çalışılabilmektedir. Ancak akıntı örneklerinde testin duyarlılığı düşüktür, örnek hücre içermelidir. Kadında endoserviks ve üretradan alınan örnekler duyarlılığı % 20 oranında arttırır (12,13).

PCR TESTLERİ

Nükleik asit probe testi, G.vaginalis, Candida türleri ve T.vaginalis’ i saptayabilir. Tek bir sürüntü örneği kullanılması, hızlı sonuç vermesi, 72 saate kadar koruyan transport sistemi olması önemli bir avantajdır (8). Ayrıca bakteriyel vajinozis ilişkili bakterilerin 16sRNA’ larını saptayan kantitatif PCR testleri geliştirilmiştir. Bu testlerin Gram preparasyonu ile konfirme edilerek tanıyı kolaylaştırdığı bildirilmektedir. Ancak maliyetlerinin yüksek olması, altın standartın halen Gram değerlendirme olması sebebiyle kullanımı sınırlıdır (13,14).

ANTİJEN TESTLERİ

Trichomonas vaginalis tanısı için immunkromatografik hızlı testler geliştirilmiştir. Duyarlılığı % 84-95, özgüllüğü % 99 olarak bildirilmektedir. Mikroskopi ve kültürün yapılamadığı durumlarda kullanılabilir.

Chlamydia trachomatis tanısında, klamidyal lipopolisakkaritleri saptamak için monoklonal veya poliklonal antikorların kullanıldığı enzim immununoassay (EIA) testleri mevcuttur. Bu testlerin duyarlılığı % 83, özgüllüğü % 99 olarak bildirilmektedir. Servikal, üretral sürüntü ve idrar örneklerinde çalışılmaktadır. Örneklerin yeterince hücre içermemesi sonuçları etkilemektedir. NAAT testleri kültürün yerine “yakın bir geçmişte” altın standart olarak tanımlandığı için, henüz yeterince karşılaştırmalı çalışma verisi yoktur. NAAT testlerine göre ucuz olması, hızlı tanı sağlaması tanıda sıklıkla tercih edilmesine neden olmaktadır. Chlamydia trachomatis tanısında kullanılan bir diğer test, direkt fluorescein antikor (DFA) testidir. Major dış membran proteininin (MOMP) C.trachomatis’e spesifik epitopuna karşı fluorescein isothiocyanate (FITC) ile konjuge monoklonal antikorlar kullanılır. Yaymada elementer cisimlerin saptanmasına dayanır. DFA kültür ile karşılaştırıldığında duyarlılığı % 75-85, özgüllüğü % 97-98’ tir. NAAT mevcut veya ekonomik olmadığında, kadınlarda endoservikal, erkeklerde uretral sürüntülerde alternatif test olarak değerlendirilebilir (14,15).

DİĞER TESTLER

Bakteriyel vajinozis tanısında G.vajinalis ve Mobiluncus türleri tarafından üretilen sialidaz enzim aktivitesini tespit eden testler geliştirilmiştir. Bu testlerin duyarlılığı % 90’dan fazla, özgüllüğü % 97’ dir. Hızlı sonuç alınabilmesi önemli avantajlarıdır (1,8).

KAYNAKLAR

1. Centers for Disease Control and Prevention. Diseases Characterized by vaginal Discharge-Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines, 2010. CDC; Department of Health and Human Services, Atlanta, GA 2011

2. Faculty of Sexual & Reproductive Healthcare Clinical Guidance: Management of Vaginal Discharge in Non-Genitourinary Medicine Settings, February 2012

3. Kumar N, Behera B, Sagiri S, Pal K, Ray S, Roy S. Bacterial vaginosis: Etiology and modalities of traetment-A brief note. J Pharm Bioallied Sci. 2011 Oct-Dec; 3(4):496-593

4. Garcia Lynne S. (Editor in Chief), Clinical Microbiology Procedures Handbook, Second Edition Update. Guidelines for Performance of Genital Cultures 3.9.1.1-3.9.1.16

5. Larsen B and Monif G.R. Understanding the Bacterial Flora of the Female Genital Tract. Clinical Infectious Diseaes 2001;32e69-77

6. UK Standarts for Microbiology Investigations: Investigation of Genital Tract and Associated Specimens. Issued by the Standarts Unit, Microbiology Services Division, HPA Bacteriology/b28/Issue no:4,3/Issue date:18.12.12/Page:1of 36

7. Sherrard J, Donders G, White D. 2011 European (IUSTI/WHO) Guideline on the Management of Vaginal Discharge

8. Mashburn J et al, Etiology, Diagnosis, and Management of Vaginitis Journal of Midwifery and Women’s Health, 2006; 51(6):423-430

9. Nugent RP, Krohn MA, Hiller SL: reability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of Gram stain interpretation. J Clin Microbiol 1991,29:297-301

10. Amsel R, Totten PA, Spiegel Ca, Chen KC, Escherbach D, Holmes KK. Nonspecificvaginitis:diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med 1983;74:14-22

11. Sha EB, Chen EY, Wang QJ, Zarrifard MR, Cohen MH,Spear GT. Utility of Amsel Criteria, Nugent Score, and Quantitative PCR for Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, and Lactobacillus spp. for Diagnosis of Bacterial Vaginosis in Human Immunodeficiency Virus-Infected Women J Clin Microbiol. 2005 September; 43(9): 4607–4612.

12. Clevland Clinic Journal of Medicine Volume 81 • Number 2 February 2014

13. Expert Rev Anti Infect Ther. 2014 June ; 12(6): 657–672

14. Johnson R et al, Screening Test to Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Infections. CDC’s Guidelines, October 18, 2002.

15. Marrazzo J, Clinical manifestations and diagnosis of Chlamydia trachomatis infections, www.uptodate.com ©2013 UpToDate

 

Diyabet Tanısında Otoantikorlar – 14.10.2015

DİYABET TANISINDA OTOANTİKORLAR

Günümüzde diyabet sıklığı ve yarattığı sorunlar nedeniyle tüm dünyada önemi gittikçe artan bir sağlık sorunudur. Diyabet tüm dünyada ölüm nedenleri arasında 8. sırada yer almaktadır (1) ve 2013 yılında 5.1 milyon insanın diyabet ve komplikasyonları nedeniyle hayatını kaybettiği rapor edilmiştir (2).

Diyabet tip 1, tip 2, spesifik nedenlere bağlı diyabet ve gebelik diyabeti olmak üzere başlıca 4 gruba ayrılır.

Kronik ve ilerleyici bir hastalık olan Tip 1 diyabet, pankreas beta adacık hücrelerinin yıkımı ile seyreder. Bu yıkımın çoğunlukla otoimmun kökenli olduğu bilinmekle beraber, bazı vakalarda etiyoloji saptanamamaktadır. Genellikle çocukluk ya da adolesan çağda tanı konur. Amerikan Diyabet Birliği (ADA) hastalığın etiyolojik kriterlere göre tip 1A (İmmun aracılı) ve tip 1B (Diyabetin ağır insülin yetersizliği ile seyreden diğer formları) olmak üzere iki ana başlıkta incelenmesini önermektedir (3).

Diyabete özgü otoimmun göstergelerin ölçümü, tip 1A diyabetin erken tip 2 diyabetten ayırımı ve erişkinde gizli otoimmun diyabet (LADA) vakalarının tesbiti gibi durumlarda önemli yararlar sağlamaktadır. Ayrıca tip 1A diyabetin önlenmesine ilişkin çalışmalarda riskli kişilerin tespit edilmesi ve izlenmesinde otoimmun göstergelere ihtiyaç vardır.

“Adacık otoantikoru”, Langerhans adacıklarına veya spesifik olarak insülin salgılayan β hücrelerine yönelik oluşmuş bir grup otoantikor için kullanılan bir tanımdır. Tip1A diyabete yol açan β hücre ölümünün, genetik yatkınlığı olan bireylerde (4) henüz keşfedilmekte olan çevresel faktörlerin (5) başlattığı hücresel aracılı otoimmün bir sürecin (6) sonucu olarak ortaya çıktığı düşünülmektedir.

Adacık otoantikorları genellikle Tip1 diyabetin başlangıcında vardır ve değişen sürelerle kanda bulunur. Daha da önemlisi adacık otoantikorları tip1 diyabet başlangıcından aylar hatta yıllar öncesinden oluşmaktadır (7).

Almanya’da yapılan BABY-DIAB çalışması (8) ve DAISY (Diabetes Autoimmunity Study in the Young) çalışmasına göre adacık otoantikorları yaşamın erken döneminde oluşmakta ve daha sonra ortaya çıkacak olan bir tip1 diyabetin tahmin edilmesini sağlamaktadır. Sürdürülmekte olan TEDDY (The Environmental Determinants of Diabetes in the Young) çalışması gibi benzer çalışmalar vardır. (9)

Adacık otoantikorları tip1 diyabetin sebebi olarak düşünülmemektedir. Bununla birlikte adacık otoantikorlarının pozitif bulunması, bu bireylerde belirli adacık antijenlerinin yabancı olarak algılandığının ve bir immün cevap oluşturduğunun kanıtıdır.

Yeni başlayan Tip 1 diyabetli olgularda birçok yapıya karşı otoantikor oluştuğu saptanmıştır (10) (Tablo 1).

 

Adacık hücre antikoru (ICA), insülin otoantikorları (IAA), anti-glutamat dekarboksilaz antikoru (anti-GAD ya da GADA), anti-tirozin fosfataz antikoru (IA-2) klinik ve araştırma konusu olarak en çok ilgi gören 4 major diyabet otoantikorudur. ZnT8A ise yeni araştırılmakta olan diyabet otoantikorlarından biridir (11).

Ada cık Hücre Antikor u (ICA)

Adacık hücre sitoplazmasına karşı antikorlar sadece β-hücreleri ile değil α, γ, δ ve PP (pankreatik polipeptid) hücreleri ile de etkileşime girerler. Dolayısı ile ICA tek bir yapıya karşı oluşan bir antikor değil, antikor karışımıdır. Adacık hücre antikorlarının tayini indirekt immunofloresan (IF) yöntemi ile yapılır.

Yeni tanı konulan tip 1 diyabette %80-90 gibi oldukça yüksek oranda çocuk olguda ICA pozitif bulunur (12) (Tablo 2). Bir hastada ICA titresinin yüksek bulunması , halen bir miktar Β hücresinin mevcut olduğunun ve bu hücrelerin destrüksiyonunun devam ettiğinin göstergesidir. Zaman içinde hedef dokunun iyice azalması ile titre düşer ve tip 1 diyabet tanısından 10 yıl sonra vakaların çok azında (<%5) ölçülebilir değerde kalır.

ICA tip 1 diyabet gelişiminde önemli bir prediktif göstergedir. Test pozitif çocuklarda, 1. faz insülin yanıtı 1. persentilin altında bulunmuşsa, 5 yıl içinde tip 1 diyabet gelişme olasılığı %50 yi aşmaktadır (13). Bu nedenle, tip 1A diyabetlilerin yakınları başta olmak üzere, riskli kişilerin taranmasında ICA kullanılabilmektedir.

İnsülin Otoantikorları (IAA)

İnsülin β-hücresine spesifik otoantikordur. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) veya tercihen Radio-ligand binding assay (RBA) ya da Radioimmuno assay (RIA) ile tayin edilebilir. Yeni tanı konulan tip 1 diyabetli çocukların %50- 70’inde insülin otoantikoru (IAA) pozitif bulunur. Buna karşılık erişkin hastalarda sadece %20-30 olguda insüline karşı otoantikor vardır (12) (Tablo 2). Yaşı 15’in altında olan diyabetlilerde IAA pozitif bulunma oranı cinsiyet farkı göstermez iken, 15 yaş üzerinde erkek/kadın oranı 2/1’dir (14). İnsülin otoantikorlarının prediktif değeri ICA’ya kıyasla daha zayıftır. Bu nedenle β-hücre otoimmunitesini belirlemede tek başına kullanılmasından ziyade, diğer otoimmun belirteçlerle birlikte destekleyici olarak IAA’dan yararlanılması önerilmektedir.

Gluta mik Asit Dekarboksila z Antikorları (GADA)

1980’li yıllarda tip 1A diyabetli vakalarda tanıdan 10 yıl sonra dahi kalıcı olabilen, 64.000 Dalton ağırlığındaki adacık protein oto-antijenine karşı antikor tanımlanmıştır. 1990 yılında bu otoantijenin gama-amino bütirik asit (GABA) sentezinde hız kısıtlayıcı bir enzim olarak bilinen ve esas olarak merkezi sinir sisteminde bulunmakla birlikte pankreas adacık hücreleri, testis, over, adrenal bez ve böbrek gibi başka bazı ekstranöronal dokularda da sentezlenen glutamik asit dekarboksilaz (GAD) olduğu anlaşılmıştır.

Glutamik asit dekarboksilazın %70 aminoasit homolojisi gösteren 2 izoformu vardır: GAD65 ve GAD67. Bunlardan GAD65’e karşı antikor gelişimi diyabetli hastalarda daha sıktır. GAD65 sadece β-hücreleri değil, tüm pankreas adacık hücrelerinden ekprese edilir, dolayısı ile GADA pozitif olan hastada gelişen antikor tüm adacık hücrelerine karşıdır. Diğer otoantijenlerin aksine, GAD’ın hücresel ve hümoral immuniteyi uyardığına dair kanıtlar vardır. Dolayısı ile GAD’ın tip 1A diyabette bir gösterge olmasının ötesinde etiyolojik bir faktör olduğuna inanılmaktadır.

GADA ölçümü RIA, RBA veya ELISA ile yapılabilir. Son yıllarda geliştirilen, GAD65’e karşı antikorların ölçüldüğü ticari ELISA kitleri ile RIA’dan daha yüksek duyarlılık ve benzer özgüllükte ölçüm yapılabildiği bildirilmektedir (14).

Adacık stoplazmik antikorlarına benzer şekilde, yeni tanı tip 1A diyabetlilerin %70-80 gibi önemli bir kısmında GADA pozitif bulunur (12) (Tablo 2). Bununla birlikte normal populasyonda bulunma oranı ICA’ya kıyasla daha fazladır (%2-3). Bu nedenle GADA prediyabetik dönemde ICA kadar sensitif prediktif değer taşır, ancak ICA daha spesifiktir.

GADA’nın tip 1A diyabet başlangıcından sonra uzun süre persiste etmesi, retrospektif tanıda , özellikle tanıdan birkaç yıl sonra insüline ihtiyaç gösteren geç başlangıçlı tip 1A diyabet (LADA: latent autoimmune diabetes in the adult, erişkinde gizli otoimmun diyabet) olgularında önemli avantaj sağlar (15). Tekrarlanabilir olması ve daha az fluktuasyon göstermesi testin diğer üstünlükleridir.

Anti-tirozin Fosfata z (IA-2) ve Anti-fogrin (IA-2β ) Antikorları

İnsülinoma antijeninin 40.000 Dalton ağırlığındaki intrasellüler fragmanı IA-2 olarak tanımlanmaktadır. IA-2, GAD’a benzer şekilde beyin, pankreas, hipofiz gibi farklı dokulardaki nöroendokrin hücrelerde ekprese edilir.

IA-2 antikorları ölçümünün GADA’ya göre daha az, IAA’ya göre daha yüksek duyarlılık gösterdiği bilinmektedir. Yeni tanı tip 1 diyabette; çocukluk çağındaki olgularda %60-70, erişkinlerde %30-50 oranında pozitif bulunur (12) (Tablo 2). IA-2 antikorları, rezidüel β-hücre fonksiyonu hakkında fikir verir. Yüksek titrasyonlar hızlı progresyon göstergesidir. IA-2 antikorunun hastalığa daha spesifik olduğu bilinmekte, adolesan ve erişkinlerde tip1A diyabet gelişme riskini en iyi gösteren otoimmun gösterge olduğu kabul edilmektedir (16).

Anti-fogrin antikorları, IA-2’ye benzer şekilde, protein tirozin fosfataza benzer bir proteindir ve yine nörosekretuvar hücrelerde eksprese edilir. IA-2β’ya karşı antikor varlığında hemen hemen her zaman IA-2’ye karşı da antikor bulunmakla beraber, bunun tersi doğru değildir, tip 1A diyabetli hastalardan IA-2 antikoru pozitif bulunanların %10’unda IA-2β negatiftir. Bu nedenle ikisinin birden taranması yerine IA-2’ye karşı antikor bakılması yeterli kabul edilmektedir.

Tablo 2: Tip 1 diyabet tanısı konulan hastalarda tanı konulduğu sırada diyabete yönelik otoantikorların pozitif bulunma oranları (12)

(a) Yeni başlangıçlı Tip1DM hastalarında görülme sıklığı.

(b) Bu değer çocuklar içindir; IAA yetişkinde nadir görülür.

Sonuç olarak diyabet otoantikorlarının klinik kullanımı iki ana başlıkta incelenebilir:
1-Akut başlayan ve insülin ihtiyacı olan diyabet vakalarında otoimmuniteye bağlı tip 1A diyabeti konfirme etmek ya da klinik olarak ayrımı yapılamayan durumlarda diyabet tipinin ayrımını yapmak
2-Başta tip 1A diyabetlilerin birinci derece akrabaları olmak üzere tip 1A diyabet açısından yüksek riskli kişileri belirleyip bilgilendirerek diyabeti erken teşhis etmek, mümkünse geciktirmek ve önlemek.

İnsülin eksikliğinin çok belirgin olmadığı durumlarda otoimmun diyabet tanısının olabildiğince erken konularak insülin tedavisine gecikmeden başlanmasının hastada kalan β-hücre rezervini korumada etkili olduğu ve balayı periodunu uzattığı bilinmektedir (19). Bu nedenle şüpheli olgularda otoantikor tetkiki yapılıp hastada otoimmun diabet olup olmadığı netleştirilmelidir. Ayrıca bu hastalarda diğer otoimmun hastalıklara da eğilim olması nedeni ile başta tiroid peroksidaz antikoru (Anti-TPO) olmak üzere, diğer otoantikorların da tetkik edilmesi önerilmektedir.

Kaynaklar

1. World Health Organization. The top ten causes of death . http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en.

2. International Diabetes Federation. Diabetes Atlas 6th edition 2013. http://www.idf.org/diabetesatlas.

3. American Diabetes Association. Clinical practice recommendations 2011, Diagnosis and clasification of diabetes mellitus. Diabetes care 2011;34:62-9.

4. Concannon P, Rich SS, Nepom GT. Genetics of type 1A diabetes. N Eng J med 2009;360:1646-54.

5. Peng H,Hagopian W. Environmental factors in the development of type 1 diabetes.Rev Endoc Metab Disord 2006;7:149-62.

6. Michels AW, Eisenbarth GS. Immunologic endocrine disorders. J Allergy Clin Immunol 2010;125(2 Suppl 2):S226-37.

7. Jahromi MM, Eisenbarth GS. Cellular and molecular pathogenesis of type 1A diabetes. Cell Mol Life Sci 2007;64:865- 72.

8.
 Hummel M, Bonifacio E, Schmid S, Walter M, Knopff A, Ziegler AG. Brief Communication: early appearance of islet autoantibodies predicts childhood type 1 diabetes in offspring of diabetic parents. Ann Intern Med 2004;140:882-6.

9.
 TEDDY study group. The environmental determinants of diabetes in the young (TEDDY) study.Ann NY Acad Sci 2008;1150:1-13.

10. William E. Winter, Desmond A. Schatz. Autoimmune markers in diabetes. Clinical Chemistry. 2011;57:2 168-175.

11. Wenzlau JM,Moua O,Sarkar SA,Yu L. SIC30A8 is a major target of humoral autoimmunity in type 1 diabetes and a predictive marker in prediabetes. Ann NY Acad Sci 2008;1150:256-9.

12. Seissler J,Scherbaum WA.Autoimmune diagnostics in diabetes mellitus. Clin Chem Lab Med 2006;44:133-7.

13. Riley WJ,Maclaren NK,Krisher J,Spillar RP,Silverstein JH,Schatz DA,Schwartz S,Malone J,Shah S,Vadheim C. A prospective study of the development of diabetes in relatives of patients with insülin-dependent diabetes. N Engl J Med 1990;323:1167-72.

14. Tsirogianni A,Pipi E,Soufleros K.Specifity of islet cell autoantibodies and coexistance with other organ spesific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Autoimmunity Rev 2009;8:687-91.

15. Turner R,Stratton I,Horton V,Manley S,Zimmet P,Holman R.UKPDS 25:autoantibodies to islet-cell cytoplasm and glutamic acid decarboxylase for prediction of insulin requirement in type 2 diabetes.UK prospective diabetes Study Group. Lancet 1997;350:1288-93.

16. Achenbach P,Warncke K,Reiter J,Naserke HE,Williams AJ,Bingley PJ,Bonifacio E,Ziegler AG. Stratification of type 1 diabetesrisk on the basis of islet autoantibody characteristics.Diabetes 2004;53:384-92.

17. Orban T,Sosenko JM,Cuthbertson D,Krischer JP,Jackson R et al. Pancreatic islet autoantibodies as predictors of type 1 diabetes in the Diabetes prevention trial-type1. Diabetes Care 2009;32:2269-74.

18. Schatz D,Krischer J,Horne G,Riley W,Spillar R et al. Islet cell antibodies predictinsulin dependent diabetes in United States schoolage children as powerfully as in uneffected relatives. J Clin Invest 1994;93:2403-7.

19. Shah SC,Malone JI,Simpson NE. A randomized trial of intensive insulin therapy in newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus.N Engl J Med 1989;320:550-4.

D Vitamini ve ölçüm yöntemleri – 12.06.2015

D VİTAMİNİ VE ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ

D vitamini eksikliği küresel bir salgın olarak adlandırılmaktadır. Son yıllardaki çalışmalar Vitamin D’nin mineral metabolizması dışında ikincil etkilerinin önemi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Bu nedenle 25-OH-vitamin D (25(OH)D)’nin klinik olarak doğru ölçülmesi çok büyük önem arz etmektedir. Son dönem yeni jenerasyon yöntemler arasında farklılık 25-OH Vitamin D ölçümünün zor olduğunu göstermiştir. LC-MS/MS yöntemi ve metodolojisi üzerine yapılan çalışmalar sonucunda LC-MS/MS ile 25-OH-Vitamin D ölçümü Joint Comittee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) tarafından “referans metod” olarak kabul görmüştür

 

D vitamini; yağda eriyen vitaminler grubunda olup, endojen olarak uygun biyolojik ortamda sentezlenebilmelerinden dolayı hormon ve hormon öncüleri olarak kabul edilen bir grup steroldür. En önemli etkisi kalsiyum ve fosfor metabolizması ile kemik mineralizasyonu üzerinedir. Bununla birlikte son yıllarda, D vitamini eksikliği ile yetersizliğinin yaygın kanser, kardiyovasküler hastalıklar, metabolik sendrom, enfeksiyöz ve otoimmun hastalıklar da dahil olmak üzere bir çok kronik hastalık patogeneziyle ilişkili olduğu saptanmıştır (1,2).

D vitamini eksikliği küresel bir salgın olarak adlandırılmaktadır (3). İngiltere’de yakın zamanda yapılan bir çalışmada; kış ve bahar dönemlerinde erişkin popülasyonun %50’sinden fazlasında D vitamini yetersizliği, %16’sında da ciddi D vitamini eksikliği saptandığı rapor edilmiştir (4). Son yıllarda Uçar ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada; Ankara bölgesinde oldukça yüksek oranda (%51,8) D vitamini eksikliği ve %20,7 oranında D vitamini yetersizliği tespit edilmiştir (5).

Bir ön hormon olan D vitamininin kolekalsiferol (D3 vitamini) ve ergokalsiferol (D2 vitamini) olmak üzere iki kaynağı vardır. Kolekalsiferol 290-310 nm dalga boyundaki ultraviole ışınlarının etkisiyle deride hayvansal kaynaklı olan 7-dehidrokolesterolden sentezlenir ve vücuttaki bu endojen üretim D vitamininin temel kaynağıdır. Bu dönüşüm deri pigmentasyonu arttıkça azalırken, ultraviole ışınına maruz kalma miktarı ile doğru orantılı olarak da artar. Ergokalsiferol ise bitkisel sterol olan ergosterolün irradiasyonuyla oluşur ve daha çok süt ürünlerinin güçlendirilmesi amacıyla kullanılır. Vitamin D3 ve D2 benzer yolla metabolize olduklarından ortak bir isimle, D vitamini olarak adlandırılırlar (6).

Deride yapılan veya diyetle alınan D vitamini biyolojik olarak aktif değildir. Dolaşımdaki D vitamini, vitamin D bağlayıcı protein (DBP) ile karaciğere taşınmakta ve karaciğerde 25 hidroksilaz enzimi ile 25 hidroksivitamin D’ye [25(OH)D], daha sonra da böbreklerde 1-alfa hidroksilaz enzimi ile biyolojik olarak aktif form olan ve kalsitriol olarak da bilinen 1,25 dihidroksivitamin D’ye [1,25(OH)2D] dönüşmektedir. 1-alfa hidroksilaz enzimi D vitamini sentezinde anahtar enzimdir. Bu enzimin düzenlenmesinde parathormon (PTH), kalsiyum (Ca), fosfor ve fibroblast growth faktör 23 (FGF 23) rol oynamaktadır (3,7). 1,25(OH)2D ince barsak, böbrek ve diğer dokularda bulunan vitamin D reseptörleri üzerinden etkisini gösterir. İnce barsaktan Ca absorbsiyonunu arttırarak, böbreklerden de Ca kaybını azaltarak genel fonksiyonu olan kan kalsiyum düzeyini korur. Ayrıca 1,25(OH)2D vitamininin, hücre proliferasyonunu inhibe edici, terminal diferansiyasyonu uyarıcı, anjiogenezi inhibe edici, insülin üretimini uyarıcı ve renin üretimini inhibe edici biyolojik etkileri mevcuttur (7,8). D vitamini ve metabolitleri birçok dokuda bulunan 24 hidroksilaz enzimi tarafından inaktive edilerek safra yoluyla atılmaktadır (Şekil 1), (3,9).

 

Bireysel vitamin D düzeylerini değerlendirmek için yarı ömrü 2-3 hafta olan, hem vitamin D alımını hem de endojen yapımı gösteren 25(OH)D düzeyine bakılmalıdır. Biyolojik aktif form 1,25(OH)2D ideal ölçüm için uygun değildir. Çünkü yarı ömrü 4-6 saat kadar kısa ve dolaşımdaki düzeyleri 25(OH)D’den 1000 kat daha düşüktür. D vitamini eksikliği ve yetersizliğinin tanımlanması ve 25(OH)D düzeyinin normal aralığının saptanması için birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmaların ışığında, 25(OH)D düzeyi ve yorumu Tablo 1’ de özetlenmiştir (3,8).

D Vitamini Düzeyine Hangi Durumlarda Bakılmalıdır?

  • Kemik hastalığı olan kişiler (osteomalazi, osteoporoz, paget vs.).
  • D vitamini eksikliğini düşündüren kas-iskelet sistemine ait semptomları olan kişiler
  • D vitamini eksikliği ve yetersizliği konusunda risk faktörleri olanlar (koyu tenli kişiler, güneş ışığından yeterince yararlanamayanlar, yaşlılar, obezler, kısa aralıkla sık hamile olanlar, emziren kadınlar, malabsorbsiyon durumları, antikonvülsan ve glukokortikoid ilaç kullanımı vs.).

 

Vit D ölçümünde esas olarak iki ana metadoloji kullanılmaktadır. Bunlar; kompetitif immunoassayler (RIA, enzyme immunoassay, chemiluminescent immunoassay (CLIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLİA) ve competitive protein binding assay) ve kimyasal tespit yöntemleridir. Kimyasal tespit yöntemlerinin temelini kromatografik ayırma sonrasında immunolojik olmayan direkt tespit oluşturmaktadır (HPLC ve LC-MS/ MS). Her iki yöntemin de avantajları ve dezavantajları olmasının yanısıra bu yöntemler arasında temel fark HPLC ve LC-MS/MS’ in 25OHD2 ile 25OHD3 ü ayırabilmeleridir.

 

Likit Kromatografi-Kütle Spektrometre (LC-MSMS)

Kütle spektrometreleri manyetik veya elektriksel bir alanda hareket eden yüklü partikülleri kütle/yük (m/z) oranlarına göre diğer yüklü partiküllerden ayırt ederek analizleme esasına göre çalışan cihazlardır. Moleküller normalde yüklü partiküller değillerdir. Kütle spektrometreleri iyonizasyon işlemi ile molekülleri uyararak yüklü iyonize moleküller haline dönüştürürler. Yüklü moleküller stabil olmayıp, diğer moleküllerle veya bir yüzey ile temas ettikleri zaman fragmentlerine parçalanır ve yüklerini kaybederler. Oluşan her bir iyon, spesifik bir moleküler kütleye ve yüke sahiptir ve m/z değerlerinin yoğunluğa (intensite) karşı gösterildiği bir spektrum ile bileşik tanımlanmaktadır.

Kütle spektrometreleri iyon kaynağına giren bütün bileşikleri ayrıştırır ve iyonlaştırır. Organik bileşiklerin içerisinde çok fazla sayıda molekül mevcuttur ve hepsinin kütle fragmenti izlenir. Bu nedenle iyi bir spektrum elde etmek amacıyla belirli bir sürede sadece saf bir bileşiğin kütle spektrumunu almak gereklidir. Seçimliliği yükseltmek ve deteksiyon limitlerini artırmak için kütle spektrometresinden (MS)’den önce numunenin ekstraksiyon, derivatizasyon, kromatografik ayrıştırmalar gibi bazı ön muamelelerden geçirilmesi gereklidir. Bunun için en uygun yöntemlerden birisi iki veya daha fazla analitik tekniğin art arda (tandem) bağlanmasıdır (Likit Kromatografi–Kütle Spektrometresi: LC-MS).

Analiz hızını artırmak, kompleks karışımlarda deteksiyon limitini artırmak, çoğunlukla ön işlemlere gereksinim kalmadan kompleks karışımların hızlı, hassas ve selektif olarak analizini yapmak için iyon yolunda birden fazla MS bulunabilir (Şekil 2).

 

Bu sistemlerde, komponentler arasında “collision chamber” (Çarpışma odası) bulunmaktadır. Birinci kütle analizörde seçilen ana iyon (parent) “collision chamber”da argon gibi inert bir gaz etkisiyle fragmentlerine ayrıştırılmakta (yavru iyon, daughter ion) ve bu fragmentler tekrar ikinci kütle analizörde analizlenmektedirler (10,11), (Şekil 3).

 

Kütle spektrometresinde kantitatif doğruluk analitik işlemin başlangıcında eklenen uygun internal standart (IS) ile sağlanır. Seçilen IS’ın ilgilenilen bileşiğin kimyasal yapısına uygun olması gerekir. Böylece IS’ın fiziksel ve kimyasal özelliklerinin, bilinmeyen maddeninki ile uyumlu olması sağlanır. Bu sebeple döteryumla işaretlenmiş bileşiklerin IS olarak kullanımı yaygındır. Bir bileşiğin analizinde kullanılan döteryumlanmış IS’ın tek farkı bir veya birkaç hidrojen atomu yerine döteryum atomlarının geçmiş olmasıdır (10,12).

Kütle spektrometrelerinin biyokimyada kullanımı 1956 yılında steroidlerin analizi ile başlamış, 1960’lı yıllarda peptid ve nükleosidlerin sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. İlk defa 1966 yılında Tanaka ve arkadaşlarının gaz kromatografi- kütle spektrometresi (GC-MS) ile izovalerik asidemiyi tanımlamalarıyla birlikte cihaz metabolik hastalıkların tanısında kullanılmaya başlamıştır (13). 1980’li yıllarda tandem kütle spektrometresi (TMS) geliştirilmiş ve birçok alanda kullanıma sunulmuştur. Günümüzde LC-MS/MS’in tıp alanında kullanımı gittikçe artan bir öneme sahiptir. Yüksek hassasiyeti ve güvenilirliği, analiz süresinin kısa olması ve bilgisayar kontrollü programlar sayesinde, kütle spektrometreleri artık birçok hastalığın tanısına yaklaşımda son derece kuvvetli bir analitik teknik haline gelmiştir.

25-OH-vitamin D (25(OH)D)’nin klinik olarak doğru ölçülmesi çok büyük önem arz etmektedir. Bunun için bir standartlaştırma gerekmektedir. DEQAS (Vitamin D External Quality Assessment Scheme) sonuçlarına göre; serum 25-OHD düzeylerinde ölçüm metodlarına bağlı olarak laboratuvarlar arası değişkenlikler mevcuttur. Bu değişkenliklerin nedeni; molekülün hidrofobik ve lipofilik yapısının matriks etkisine yol açması, D Vitamini Bağlayıcı Protein (DBP)’e güçlü şekilde bağlanması nedeniyle deproteinizasyon prosedürleri gerektirmesi, dolaşımda çok düşük konsantrasyonlarda (nanomolar) olmaları ve D2 ve D3’ün benzer yapısal özelliklerinin metadolojik problemlere neden olmasıdır (14,15).

Yakın zamana kadar vitamin D ölçümünde kabul edilmiş bir referans yöntem prosedürü (RMP) mevcut değildi. LC-MS/MS yöntemi ve metodolojisi üzerine yapılan çalışmalar ve 2010 yılında Tai ve arkadaşları tarafından geliştirilen aday referans metod çalışması sonucunda, LC-MS/ MS ile vit D ölçümü Joint Comittee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) tarafından “referans metod” olarak kabul görmüştür (16.17). Ayrıca US National Institute of Standards and Technologies (NIST), 25(OH)D3 ve 25(OH)D2 içeren etanol bazlı iki kalibratör standard referans materyal (SRM 2972) ve RMP olarak ortaya konan LC-MS/MS ile değerleri belirlenmiş olan dört adet serum bazlı standart referans materyelini de (SRM 972) kullanıma sunmuştur. Bunun sonucunda yöntemler arası uyumu en çok etkileyen sorunlardan biri olan kalibrasyon sorununun ortadan kalkması öngörülmüştür (18,19,20). Referans bir yöntem ve sertifikalı referans malzemelerin kullanımı ölçüm yöntemlerinin standardizasyonu ve karşılaştırılabilirliğini sağlayacaktır. Günümüzde, NIST (National Institute of Standardsand Technology) standard referans materyali (SRM) ve referans ölçüm prosedürlerinin kullanıma girmesi ile laboratuvarlar arası ölçüm değişkenliği giderek azalmaktadır.

Vitamin D ölçümünde ilk kullanılan ölçüm yöntemi 1971’de bildirilen Vitamin D binding protein’nin bağlayıcı olduğu kompetitif protein bağlama yöntemidir (21). Yöntemin avantajı DBP’nin 25(OH)D2 ile 25 (OH)D3’ü eşit olarak tanımasıdır. Yöntemin kısıtlılığı ise ölçümde 24,25(OH) 2D, 25,26 (OH) 2D, 23- Lactone gibi diğer polar vitamin D metabolitlerini de kapsaması ve 10 gün gibi uzun inkübasyon süresinin olmasıdır. Ancak Silisik asit kromotografisinin kullanıldığı kompetitif protein bağlama yöntemi geliştirilerek inkübasyon süresi 1 saate düşürülmüştür (21-23).

1977’de High Performance Liquid Chromotography (HPLC) geliştirilmiştir. Bu yöntemde UV absorbsiyon yolu ile ölçüm yapılmaktadır. Yöntemin avantajları; interferans veren lipidlerin ve vitamin D metabolitlerinin uzaklaştırması, 25(OH)D2 ve 25(OH)D3’i ayrı ayrı ölçebilmesi, stabil, spesifik, cost-effective ve tekrarlanabilirliğinin yüksek olmasıdır (21,23). Yöntemin dezavantajları ise iyi bir donanım ve deneyim gerektirmesi, ekipman maliyeti ve numune miktarının fazla olması, hazırlayıcı kromatografi gerektirmesi, interferans yapıcı UV bileşiklerden etkilenebilmesi ve test sonuçlanma sürensinin uzun olmasıdır.

1985’te RIA (Diasorin) geliştirilmiştir. Bu yöntem için örnek saflaştırması gerekli olmamaktadır. Bu yöntemin uygulaması kolay ve sonuçları HPLC ölçümü ile koreledir. Hızlı, ucuz ve doğru yöntemlerdir. İnterferansları yoktur ve numune miktarı azdır. Ancak radyoaktif ve kimyasal atık oluşturmaları, 24,25(OH)D3, 24,25(OH)D2 ve 25(OH) D3-26,23-lactone gibi polar vitamin D metabolitleri ile çapraz reaksiyon vermesi ölçümlerin %10-20 daha yüksek verilmesine neden olmaktadır. RIA (IDS) yöntemi ise 25(OH)D3’e %100, 25(OH) D2’ye %75 spesifiktir (21, 23, 24).

ELISA yöntemi RIA ve Kompetitif protein bağlama ölçümdeki gibi diğer polar vitamin D metabolitlerini de kapsamaktadır (24,25(OH) 2D, 25,26(OH) 2D, 23-lactone) (21)

Tüm dünyada artan vitamin D test sayıları laboratuvarları daha basit ve hızlı sonuç veren kemiluminesans yöntemleri kullanmaya yöneltmiş olsa da, bu yöntemlerinde birtakım dezavantajları mevcuttur (Tablo 2);

Son yıllarda “altın standard yöntem” olarak kabul edilen LC-MS/MS, internal standard kullanılmasından ve metadolojiden dolayı daha doğru ve kesin sonuçlar vermektedir. LC-MS/MS yöntemi, 25-OH-vitamin D3 (25(OH)D3) ve 25-OH-vitamin D2 (25(OH)D2) vitaminlerinin serum veya plazmada ekstraksiyondan sonra kantitatif olarak ölçülmesine dayanır. Bu da özellikle tedavilerinde D2 vitamini kullanılan hastalarda doğru sonuç elde etmek ve tedavinin takibi açısından önemlidir.

Ayrıca 2004 yılında Kamao ve arkadaşları tarafından 25- (OH)D’nin izomerizasyon sonrasında 3-epi-25-(OH)D epimerini oluşturduğu tespit edilmiştir (25). Bu epimer bebekler ve özellikle bir yaşından küçük çocuklarada 25- (OH)D düzeyinin önemli bir kısmını oluşturmaktadır (26). Vitamin D düzeylerinin doğru bir şekilde belirlenebilmesi için bu epimerik formların birbirinden ayırdedilmesi gerekmektedir. LC-MS/MS kullanılarak bu epimerik formun kromatografik olarak ayrımı mümkündür.

2012 Yılında Farrell J. ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada (27), randomize seçilen 170 hasta örneği uygun şartlarda bölünerek saklanmış ve bu örneklerden;

  • 2 farklı LC-MS/MS yöntemi
  • RIA
  • 5 farklı İmmunoassay (CLIA) kullanılarak
    – Düşük ve yüksek serum havuzu hazırlanmış
    – Her yöntem 5 tekrarlı 5 gün çalışılmıştır.

Çalışmadan elde edilen verilere göre farklı yöntemlerin korelasyon katsayısı, pearson precision ve bias korelasyon açısından değerlendirilmesi sonucu Tablo 3’de, precision çalışması ise Tablo 4’de özetlenmiştir. Bu sonuçlara göre LC-MS/MS ile yapılan ölçümlerde gün içi ve günler arası %CV’lerin düşük, presizyonun ise yüksek olduğu görülmektedir.

Sonuç olarak;

  • Son yıllardaki çalışmalar Vitamin D’nin mineral metabolizması dışında ikincil etkilerinin önemi üzerinde yoğunlaşmaktadır.
  • Vitamin D’nin otoimmun hastalıklar, kanser, enfeksiyon ve kardiyovasküler mekanizmalar üzerinde koruyucu ve önleyici bir etkisi olduğunu düşündürmektedir.
  • Günümüzde klinik açıdan 25-OH Vitamin D’nin doğru olarak ölçülmesi önemlidir.
  • Son dönem yeni jenerasyon yöntemler arasında farklılık 25-OH Vitamin D ölçümünün zor olduğunu göstermiştir.
  • Laboratuvarlar 25-OH vitamin D ölçüm metodlarını
  1. Doğruluk (Accuracy)
  2. Precision
  3. Verimlilik
  4. Maliyet
  5. İş akışlarına göre

Seçmeliler ve mutlaka çok dikkatli bir şekilde metodlarını valide etmelidirler.

  • Şüpheli Immunoassay sonuçları mutlaka LCMSMS ile doğrulanmalıdır.

KAYNAKLAR

1. Holick MF. Vitamin D: a D-lightful health perspective. Nutr Rev 2008;66: 182-94.

2.
 Hyppönen E, Boucher BJ, Berry DJ, Power C. 25-hydroxyvitamin D, IGF-1, and metabolic syndrom at 45 years of age: a cross-sectional study in the 1958 British Birth Cohort. Diabetes 2008; 57:298-305.

3. Wacker M, Holick MF. Vitamin D-Effects on Skeletal and Extraskeletal Health and the Need for Supplementation. nNutrients 2013;5:111-48.

4. Pearce SHS, Cheetham TD. Diagnosis and management of vitamin D deficiency. BMJ 2010;340:b5664.

5.
 Uçar F, Taşlıpınar MY, Soydaş AÖ, Özcan N. Ankara Etlik İhtisas Eğitim Araştırma Hastanesi’ne Başvuran Hastalarda 25-OH Vitamin D Düzeyleri. Eur J Basic Med Sci 2012;2: 12-5.

6. Koo WWK, Tsang RC. Calcium and Magnesium Homeostasis. In: MacDonald MH, Seshia MMK, Mullet MD, eds. (2005) Avery’s Neonatology Pathophysiology & Management of the Newborn, 6th edition. Philadelphia: Lippincott W&W. 847-875.

7. Öngen B, Kabaroğlu C, Parıldar Z. D Vitamini’nin Biyokimyasal ve Laboratuvar Değerlendirmesi. Türk Klinik Biyokimya Dergisi 2008;6:23-31.

8. Holick MF, Binkley NC, Bischoff-Ferrari HA, Gordon MC, Hanley DA, Heaney RP et al. Evaluation ,Treatment, and Prevention of Vitamin D Deficiency: an Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab 2011;96:1911-30.

9. Bringhurst FR, Demay MB, Krane SM, Kronenberg HM. Bone and Mineral Metabolism in Health and Disease. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, editors. Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16th edition. New York:MCGraw-Hill Companies; 2005. p. 2238-86.

10. Lehrer M. In Kaplan LA. Mass spectrometry.St. Louis:Mosby Company, 1996; 167-84.

11.
 Hochstrasser DF, Sanchez JC, Appel RD. Proteomics and its trends facing nature’s complexity. Proteomics 2002; 2:807-12.

12. Andersen BD, Wise BL. Textbook of clinical chemistry. Philadelphia: WB Saunders Company, 1986; 197-208.

Closstiridium difficile İnfeksiyonlarının Laboratuvar Tanısı – 28.05.2015

CLOSTRIDIUM DIFFICILE İNFEKSİYONLARININ LABORATUVAR TANISI

Clostridium difficile, Gram pozitif, anaerop, sporlu bir basildir. C.difficile infeksiyonları antibiyotiğe bağlı diyareden, ağır psödomembranöz kolite kadar değişebilmektedir. Virülanstaki farlılıklar ve antibiyotik tedavisindeki değişiklikler nedeniyle son dönemlerde C.difficile infeksiyonlarının morbidite ve mortalitesinde artış gözlenmektedir. Bu nedenle tanıda hızlı ve duyarlı yöntemlere gereksinim duyulmaktadır. Tanıda altın standart toksijenik kültür yöntemidir fakat hızlı tanıda pratik değillerdir. Yeni nesil, Real-time PCR yöntemi, Hızlı ve ELISA ile karşılaştırıldığında daha duyarlı bir yöntemdir.

CLOSTRIDIUM DIFFICILE İNFEKSİYONLARININ
LABORATUVAR TANISI

Clostridium difficile, Gram pozitif, anaerop, sporlu bir basildir.

C.difficile’nin toksijenik ve toksijenik olmayan kökenleri sağlıklı bireylerde asemptomatik olarak bulunabilir. Sağlıklı erişkinlerde taşıyıcılık oranı yaklaşık % 5 iken, yenidoğan bebeklerde % 70 civarındadır. Toksijenik suşlarla kolonize olan yenidoğanlarda infeksiyon görülme sıklığı azdır çünkü yenidoğan barsak mukoza epitelinde toksin reseptörleri henüz gelişmemiştir. (2,5,7)

C.difficile sporları hastanelerde, bakımevlerinde yaygın olarak bulunmaktadır. Bu sporlar çevreden ya da taşıyıcı hastalardan, sağlık personelinin elleri ile diğer hastalara geçirilmektedir. Hastanede yatan hastalarda % 50’lere varabilen kolonizasyon oranları bildirilmektedir. (2,5,7)

C.difficile infeksiyonları antibiyotiğe bağlı diyareden, ağır psödomembranöz kolite kadar değişebilmektedir. C.difficile infeksiyonlarında kanlı ve mukuslu ishal, kramp şeklinde karın ağrısı, lökositoz ve ateş görülebilir. (2,5,7)

Günümüzde özellikle hastanede yatan, altta yatan hastalığı bulunan, yaşlı hastalarda antibiyotik kullanımı ile ilişkili infeksiyonlara neden olan C.difficile’nin toplumdan kazanılmış infeksiyonlara da neden olduğu bilinmektedir. (2,5,7)

C.difficile’ye bağlı ishal oluşumunda en önemli risk faktörlerinden birisi antibiyotik ve kemoterapötik kullanımıdır. İnfeksiyon, antibiyotik veya antineoplastik ajanların kullanımı sırasında barsak florasının bozulmasıyla meydana gelmektedir.(2,5,7)

C.difficile’nin Toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin) olmak üzere iki önemli toksini vardır. Bakterinin virulansı bu iki toksinin üretimine bağlıdır. Bu toksinler epitel hücrelerinde inflamasyona ve mukozal bütünlüğün bozulmasına neden olmaktadırlar. (2,5,7)

Toksijenik suşların genomunda bulunan patojenite lokusunda bulunan tcdA ve tcdB genleri toksinlerin sentezinden sorumludurlar. Çeşitli ülkelerde hastane salgınlarına yol açan virülansı yüksek B1/NAP1/027 kökeninin, tcdC geninde delesyon olduğu, buna bağlı olarak yüksek düzeyde toksin A ve B salgıladığı bildirilmiştir. (2,5,7)

B1/NAP1/027 kökeninin aynı zamanda ‘’binary toksin’’ olarak tanımlanan üçüncü bir toksin ürettiği de gösterilmiştir. Patojenite lokusu dışındaki cdtA ve cdtB genleri ‘’binary’’ toksini (CDT) kodlamaktadır. Bu toksinin epitel hücre yüzeyinde mikrotübül oluşumunu indüklediği ve daha çok sayıda bakterinin hücre yüzeyine tutunmasını sağladığı düşünülmektedir. Bu nedenle bu toksin daha şiddetli infeksiyonlara neden olmaktadır. (2,5,7)

Binary toksin, C.difficile kökenlerinde tek başına bulunabilir, diğer toksin A ve toksin B salgılayan veya varyant kökenlerde de bulunabilir. En sık (%65) tcdA ve tcdB toksinlerinin ikisini de üreten kökenler görülmektedir. TcdB ise kökenlerin %97’si tarafından üretilir.

Hipervirülan epidemik suşun bir diğer özelliği de diğer suşlardan farklı olarak florokinolonlara dirençli oluşudur. (2,5,7)

LABORATUVAR TANI (1,2,3,4,5,6,7):

Virülanstaki farlılıklar ve antibiyotik tedavisindeki değişiklikler nedeniyle son dönemlerde C.difficile infeksiyonlarının morbidite ve mortalitesinde artış gözlenmektedir. Bu nedenle tanıda hızlı ve duyarlı yöntemlere gereksinim duyulmaktadır.

Tanıda altın standart toksijenik kültür yöntemidir. (Anaerop kültür+Hücre kültürü sitotoksin testi) Özgüllük ve duyarlılığı yüksektir. Toksin B’yi saptar. Bu testler zaman alan (3 gün), özel ekipman ve deneyimli eleman gerektiren, maliyeti yüksek testlerdir. Bu yüzden hızlı tanıda pratik değillerdir.

EIA ile C.difficile GDH saptanması. Glutamat Dehidrogenaz çoğu toksijenik ve nontoksijenik Clostridium difficile kökenlerinde bulunabilen bir hücre yüzey proteinidir. Bu test hızlıdır ancak toksijenik ve toksijenik olmayan suşları birbirinden ayıramamaktadır. GDH’yı tespit eden testlerde düşük spesifisitesinden dolayı pozitiflik saptandığında daha spesifik bir yöntemle (ELISA, hücre kültürü, moleküler yöntemler gibi toksin üreten genleri tanımlayan yöntemlerle) doğrulanmalıdır.

Toksin A ve B için ELISA: Hızlı ve kolay testler olmasına rağmen bu testlerin genellikle duyarlılıkları ve özgüllükleri hücre kültür sistemlerine ve moleküler yöntemlere göre düşüktür. ELISA ile ancak 100-1000 pg toksin A veya B saptanabilmektedir. Bu nedenle %10-20 oranında bir yalancı negatiflik söz konusudur.

Moleküler testler toksijenik C.difficile DNA’sının amplifikasyonuna dayanır. Hız ve güvenilirlik avantajları vardır. Aynı zamanda çok daha şiddetli infeksiyonlara neden olan binary toksin ve varyant kökenleri saptayabilme avantajları vardır.

Real-time PCR yöntemi, tcdB, CdtA ve CdtB genlerine sahip kökenleri (binary toksin) ve tcdC genindeki delesyonları da belirleyebilir. Hızlı ve ELISA ile karşılaştırıldığında daha duyarlı bir yöntemdir.( Duyarlılık % 88-96, Özgüllük %94-100)

Günümüzde yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri, binary toksin ve varyant kökenleri saptayabilme avantajlarından dolayı bu testler klinik pratikte toksijenik C.difficile’nin saptanmasında ELISA testlerinin yerini almaktadırlar.

 

KAYNAKLAR

1. Susan M.NW, Elizabeth M.M et al. 2010. Clostridium difficile testing in the clinical laboratory by use of multiple testing algorithms. Journal of Clinical Microbiology, Mar.2010, p.889-893

2.
 Bartlett JG and Gerding DN.2008. Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis 46(Suppl 1):S12-S18.

3.
 Haihui H, Andrej W et al. 2009. Comparison of a commercial multiplex real-time PCR to the cell cytotoxicity neutralization assay for diagnosis of Clostridium difficile infections. Journal of Clinical Microbiology, Nov. 2009, p.3729-3731.

4. Kimberle Chapin. 2012. Discrepancies in testing recommendations for Clostridium difficile infection: updated review favors amplification test systems. Expert Rev. Mol. Diagn. 12(3), 223-226 (2012).

5. Deniz U, Ülger N ve ark.2011. Marmara Üniversitesi Hastanesinde yatan ishalli hastalardan izole edilen Clostridium difficile kökenlerinde toksin genlerinin araştırılması. Mikrobiyol Bul 2011; 45 (1):1-10.

6.
 Elizabeth J Kvach, David Ferguson et al. Comparison of BD GeneOhm Cdiff Real-Time PCR assay with a two step algorithm and a toxin A/B enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of toxigenic Clostridium difficile infection. J.Clin.Microbiol.
2010, 48(1):109.

7. Murray Patrick R, Baron Ellen Jo. Manual of Clinical Microbiology, Cilt 2, 9.Baskı, s.889-910

 

ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ Eğitimi

07.05.2015 tarihinde Prof. Dr. Tanju Atamer tarafından ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ (Protein Elektroforezi ve İmmunelektroforez) Eğitimi verilmiştir.

PRO-PSA Toplantısı

30 Nisan 2014 tarihinde gerçekleştirilen Pro-PSA konulu toplantının sunumlarını Liquid Biopsi (Mayıs 2014) Pro-PSA (Mayıs 2014) Prostat Kanseri Konusunda Yenilikler(Mayıs 2014) adlarıyla, web sitemizin Bilimsel Bültenler başlığı altında bulabilirsiniz.