Closstiridium difficile İnfeksiyonlarının Laboratuvar Tanısı – 28.05.2015

CLOSTRIDIUM DIFFICILE İNFEKSİYONLARININ LABORATUVAR TANISI

Clostridium difficile, Gram pozitif, anaerop, sporlu bir basildir. C.difficile infeksiyonları antibiyotiğe bağlı diyareden, ağır psödomembranöz kolite kadar değişebilmektedir. Virülanstaki farlılıklar ve antibiyotik tedavisindeki değişiklikler nedeniyle son dönemlerde C.difficile infeksiyonlarının morbidite ve mortalitesinde artış gözlenmektedir. Bu nedenle tanıda hızlı ve duyarlı yöntemlere gereksinim duyulmaktadır. Tanıda altın standart toksijenik kültür yöntemidir fakat hızlı tanıda pratik değillerdir. Yeni nesil, Real-time PCR yöntemi, Hızlı ve ELISA ile karşılaştırıldığında daha duyarlı bir yöntemdir.

CLOSTRIDIUM DIFFICILE İNFEKSİYONLARININ
LABORATUVAR TANISI

Clostridium difficile, Gram pozitif, anaerop, sporlu bir basildir.

C.difficile’nin toksijenik ve toksijenik olmayan kökenleri sağlıklı bireylerde asemptomatik olarak bulunabilir. Sağlıklı erişkinlerde taşıyıcılık oranı yaklaşık % 5 iken, yenidoğan bebeklerde % 70 civarındadır. Toksijenik suşlarla kolonize olan yenidoğanlarda infeksiyon görülme sıklığı azdır çünkü yenidoğan barsak mukoza epitelinde toksin reseptörleri henüz gelişmemiştir. (2,5,7)

C.difficile sporları hastanelerde, bakımevlerinde yaygın olarak bulunmaktadır. Bu sporlar çevreden ya da taşıyıcı hastalardan, sağlık personelinin elleri ile diğer hastalara geçirilmektedir. Hastanede yatan hastalarda % 50’lere varabilen kolonizasyon oranları bildirilmektedir. (2,5,7)

C.difficile infeksiyonları antibiyotiğe bağlı diyareden, ağır psödomembranöz kolite kadar değişebilmektedir. C.difficile infeksiyonlarında kanlı ve mukuslu ishal, kramp şeklinde karın ağrısı, lökositoz ve ateş görülebilir. (2,5,7)

Günümüzde özellikle hastanede yatan, altta yatan hastalığı bulunan, yaşlı hastalarda antibiyotik kullanımı ile ilişkili infeksiyonlara neden olan C.difficile’nin toplumdan kazanılmış infeksiyonlara da neden olduğu bilinmektedir. (2,5,7)

C.difficile’ye bağlı ishal oluşumunda en önemli risk faktörlerinden birisi antibiyotik ve kemoterapötik kullanımıdır. İnfeksiyon, antibiyotik veya antineoplastik ajanların kullanımı sırasında barsak florasının bozulmasıyla meydana gelmektedir.(2,5,7)

C.difficile’nin Toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin) olmak üzere iki önemli toksini vardır. Bakterinin virulansı bu iki toksinin üretimine bağlıdır. Bu toksinler epitel hücrelerinde inflamasyona ve mukozal bütünlüğün bozulmasına neden olmaktadırlar. (2,5,7)

Toksijenik suşların genomunda bulunan patojenite lokusunda bulunan tcdA ve tcdB genleri toksinlerin sentezinden sorumludurlar. Çeşitli ülkelerde hastane salgınlarına yol açan virülansı yüksek B1/NAP1/027 kökeninin, tcdC geninde delesyon olduğu, buna bağlı olarak yüksek düzeyde toksin A ve B salgıladığı bildirilmiştir. (2,5,7)

B1/NAP1/027 kökeninin aynı zamanda ‘’binary toksin’’ olarak tanımlanan üçüncü bir toksin ürettiği de gösterilmiştir. Patojenite lokusu dışındaki cdtA ve cdtB genleri ‘’binary’’ toksini (CDT) kodlamaktadır. Bu toksinin epitel hücre yüzeyinde mikrotübül oluşumunu indüklediği ve daha çok sayıda bakterinin hücre yüzeyine tutunmasını sağladığı düşünülmektedir. Bu nedenle bu toksin daha şiddetli infeksiyonlara neden olmaktadır. (2,5,7)

Binary toksin, C.difficile kökenlerinde tek başına bulunabilir, diğer toksin A ve toksin B salgılayan veya varyant kökenlerde de bulunabilir. En sık (%65) tcdA ve tcdB toksinlerinin ikisini de üreten kökenler görülmektedir. TcdB ise kökenlerin %97’si tarafından üretilir.

Hipervirülan epidemik suşun bir diğer özelliği de diğer suşlardan farklı olarak florokinolonlara dirençli oluşudur. (2,5,7)

LABORATUVAR TANI (1,2,3,4,5,6,7):

Virülanstaki farlılıklar ve antibiyotik tedavisindeki değişiklikler nedeniyle son dönemlerde C.difficile infeksiyonlarının morbidite ve mortalitesinde artış gözlenmektedir. Bu nedenle tanıda hızlı ve duyarlı yöntemlere gereksinim duyulmaktadır.

Tanıda altın standart toksijenik kültür yöntemidir. (Anaerop kültür+Hücre kültürü sitotoksin testi) Özgüllük ve duyarlılığı yüksektir. Toksin B’yi saptar. Bu testler zaman alan (3 gün), özel ekipman ve deneyimli eleman gerektiren, maliyeti yüksek testlerdir. Bu yüzden hızlı tanıda pratik değillerdir.

EIA ile C.difficile GDH saptanması. Glutamat Dehidrogenaz çoğu toksijenik ve nontoksijenik Clostridium difficile kökenlerinde bulunabilen bir hücre yüzey proteinidir. Bu test hızlıdır ancak toksijenik ve toksijenik olmayan suşları birbirinden ayıramamaktadır. GDH’yı tespit eden testlerde düşük spesifisitesinden dolayı pozitiflik saptandığında daha spesifik bir yöntemle (ELISA, hücre kültürü, moleküler yöntemler gibi toksin üreten genleri tanımlayan yöntemlerle) doğrulanmalıdır.

Toksin A ve B için ELISA: Hızlı ve kolay testler olmasına rağmen bu testlerin genellikle duyarlılıkları ve özgüllükleri hücre kültür sistemlerine ve moleküler yöntemlere göre düşüktür. ELISA ile ancak 100-1000 pg toksin A veya B saptanabilmektedir. Bu nedenle %10-20 oranında bir yalancı negatiflik söz konusudur.

Moleküler testler toksijenik C.difficile DNA’sının amplifikasyonuna dayanır. Hız ve güvenilirlik avantajları vardır. Aynı zamanda çok daha şiddetli infeksiyonlara neden olan binary toksin ve varyant kökenleri saptayabilme avantajları vardır.

Real-time PCR yöntemi, tcdB, CdtA ve CdtB genlerine sahip kökenleri (binary toksin) ve tcdC genindeki delesyonları da belirleyebilir. Hızlı ve ELISA ile karşılaştırıldığında daha duyarlı bir yöntemdir.( Duyarlılık % 88-96, Özgüllük %94-100)

Günümüzde yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri, binary toksin ve varyant kökenleri saptayabilme avantajlarından dolayı bu testler klinik pratikte toksijenik C.difficile’nin saptanmasında ELISA testlerinin yerini almaktadırlar.

 

KAYNAKLAR

1. Susan M.NW, Elizabeth M.M et al. 2010. Clostridium difficile testing in the clinical laboratory by use of multiple testing algorithms. Journal of Clinical Microbiology, Mar.2010, p.889-893

2.
 Bartlett JG and Gerding DN.2008. Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis 46(Suppl 1):S12-S18.

3.
 Haihui H, Andrej W et al. 2009. Comparison of a commercial multiplex real-time PCR to the cell cytotoxicity neutralization assay for diagnosis of Clostridium difficile infections. Journal of Clinical Microbiology, Nov. 2009, p.3729-3731.

4. Kimberle Chapin. 2012. Discrepancies in testing recommendations for Clostridium difficile infection: updated review favors amplification test systems. Expert Rev. Mol. Diagn. 12(3), 223-226 (2012).

5. Deniz U, Ülger N ve ark.2011. Marmara Üniversitesi Hastanesinde yatan ishalli hastalardan izole edilen Clostridium difficile kökenlerinde toksin genlerinin araştırılması. Mikrobiyol Bul 2011; 45 (1):1-10.

6.
 Elizabeth J Kvach, David Ferguson et al. Comparison of BD GeneOhm Cdiff Real-Time PCR assay with a two step algorithm and a toxin A/B enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of toxigenic Clostridium difficile infection. J.Clin.Microbiol.
2010, 48(1):109.

7. Murray Patrick R, Baron Ellen Jo. Manual of Clinical Microbiology, Cilt 2, 9.Baskı, s.889-910

 

ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ Eğitimi

07.05.2015 tarihinde Prof. Dr. Tanju Atamer tarafından ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ (Protein Elektroforezi ve İmmunelektroforez) Eğitimi verilmiştir.